5-FU对小鼠肠屏障的影响及益生元/菌的保护作用

宗 静 陈羽飞 刘玉琴 于健春

肠屏障由免疫屏障(相关淋巴组织)、机械屏障(肠上皮屏障及黏液层)、化学屏障(溶菌酶等)及生物屏障(常驻菌群)构成，这些屏障在对抗食物残渣等对肠黏膜的损伤以及阻止病原微生物入侵机体过程中发挥巨大作用[1]。肠上皮细胞间紧密连接(tight junction，TJ)是构成肠上皮屏障的重要结构。研究发现，Claudin1蛋白是TJ的重要蛋白，其表达水平与肠黏膜通透性有一定关系[2]。肠黏膜黏液层主要由杯状细胞产生的黏蛋白(mucin,MUC)组成，结肠黏膜层以MUC2为主，可阻止病原微生物对肠上皮的黏附及损伤[3]。潘氏细胞(paneth cells,PCs)是小肠腺的特征细胞，其分泌的溶菌酶(lysozyme)等多种抗菌物质在抑制细菌过度增殖，维持肠道稳态方面起重要作用。

化疗是目前肿瘤治疗的一线治疗(手术、化疗、放疗)方法之一[4]。化疗可对机体造成全身性损害，以往文献多是研究其对肠道功能(免疫、消化、吸收、排泄)的影响，但对肠屏障的影响观察不多[5～8]。本研究利用实验体系，在动物体内观察常用化疗药物5-FU对肠免疫屏障(淋巴小结)、机械屏障(TJ/MUC2/Claudin-1)及化学屏障(溶菌酶)的影响。近年来研究发现益生元及益生菌对肠屏障有一定改善作用，因此本研究还观察了益生元、益生菌对小鼠肠屏障的保护作用[9]。

材料与方法

1.主要试剂:所用一抗为抗Claudin1 兔多克隆抗体(货号13050-1-AP)，抗MUC2兔多克隆抗体(货号27675-1-AP),抗Lysozyme兔多克隆抗体(货号15013-1-AP)及抗CD45兔多克隆抗体(货号20103-1-AP)均购自美国Proteintech公司；二抗使用通用二步法检测试剂盒(货号PV-9000)，抗体稀释液及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。苏木精-伊红(HE)染料为实验室现有。氟尿嘧啶注射液(5-FU)购自天津金耀药业有限公司，培菲康(双歧杆菌三联活菌胶囊，临床常用益生菌)购自上海信谊药厂有限公司，能全力(肠内营养混悬液，临床常用的益生元制剂)购自纽迪希亚制药(无锡)有限公司。

2.实验动物分组及处理：10周龄BALB/c雄性小鼠25只，平均体质量为30±2g,购自中国食品药品检定研究院，实验动物许可证号：SCXK(京)2017-0005。适应性喂养1周后，将其随机分成5组，每组5只，分别为对照组、5-FU组、5-FU +益生元组、5-FU +益生菌组、5-FU +益生元+益生菌组。每只小鼠40mg/kg体质量腹腔隔天注射5-FU；每日进行肠内营养素制剂益生元0.5毫升/只灌胃处理；每日进行益生菌0.5毫升/只(109CFU/ml)灌胃处理。

3.实验观察及取样：除前述处理外，每天进行一般情况观察，保证饮水及食物，观察并记录小鼠体表毛发、精神及活动状态，每3天称量体质量，2周后颈椎脱位法处死全部小鼠，解剖并快速取小肠及结肠组织，各取1cm左右用0.9%NaCl溶液冲洗干净，放置4%中性甲醛水溶液中固定。

4.HE染色：肠组织固定48h后进行脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片、烤片、二甲苯脱蜡、乙醇至水、苏木精染色、盐酸乙醇分化、氨水返蓝、伊红染色，常规梯度浓度乙醇逐级脱水后二甲苯透明、树胶封片、显微镜下观察。

5.免疫组化染色:将石蜡包埋后的组织切片、二甲苯脱蜡、乙醇至水，将插入切片的支架放在0.01mol/L EDTA缓冲液中，高压锅内煮沸2min进行抗原修复，待切片冷却后滴加过氧化氢阻断内源性过氧化氢酶15min，PBS冲洗后用羊血清封闭20min；随后分别将抗Claudin1 兔多克隆抗体用抗体稀释液1∶200稀释，抗Lysozyme、MUC2及CD45兔多克隆抗体1∶400稀释，滴加到相应切片上4℃过夜；PBS冲洗后滴加PV9000反应增强液20min后PBS冲洗，滴加增强酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物20min后PBS冲洗；DAB显色，苏木精复染、脱水、透明、封片、显微镜下定性观察。

结 果

1.各组动物一般情况观察：与对照组比较，5-FU组小鼠进食减少，活动度减退，精神萎靡不振，体毛杂乱无光泽，体质量大幅下降(P<0.05)。5-FU+益生元组及5-FU+益生菌组情况相似，毛色光泽度及活动度较5-FU组好转，但体质量仍呈下降趋势，3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。5-FU+益生元+益生菌组情况得到很好改善，小鼠进食与对照组近似，活动度好于5-FU+益生菌组及5-FU+益生元组，毛色光泽度明显好转，体质量有较明显增长，与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，与5-FU组、5-FU+益生菌组及5-FU+益生元组比较，体质量有所增加(P<0.05)，详见图1及表1。

表1 各组小鼠实验始末体质量变化

2.组织病理学观察5-FU及益生元、益生菌对肠组织形态的影响：对照组结肠组织黏膜完好，皱襞清晰，肠腔内干净无坏死物，淋巴小结形态明显，境界清晰。5-FU组结肠组织结构破坏严重，黏膜缺失，皱襞大量断裂，肠腔内充满坏死脱落物，淋巴小结出现不典型增生，境界模糊难辨。5-FU+益生菌组及5-FU+益生元组情况较5-FU组有所改善，但仍存在黏膜缺失、皱襞断裂、肠腔内有脱落坏死物的现象。5-FU+益生元+益生菌组，情况明显改善，结肠组织结构基本完整，皱襞及黏膜少见或基本无缺失，肠腔内少见脱落坏死物，淋巴小结境界清晰，形态良好。鉴于HE观察益生元和益生菌联合使用时对5-FU的毒性逆转作用更明显，后续组化只观察对照组、5-FU组和5-FU+益生元+益生菌组，详见图2。

3.5-FU及益生元、益生菌对肠免疫屏障的影响：CD45是白细胞共同抗原，能正常发育增殖具备免疫功能的淋巴细胞CD45都呈阳性。对照组结肠组织中淋巴小结境界清晰，生发中心明显，增殖细胞较多。5-FU组淋巴小结境界模糊，生发中心不明显，细胞数量显著减少且出现明显空泡。5-FU+益生元+益生菌组较5-FU组淋巴小结境界清晰，生发中心较明显且细胞数量显著增加，虽然不及对照组，但也可表明益生元益生菌联用减轻了5-FU毒性作用，详见图3。

4.5-FU及益生元、益生菌对肠机械屏障的影响：对照组肠上皮细胞间紧密连接蛋白Claudin-1及黏液层中MUC2蛋白含量丰富，分布均匀。5-FU组Claudin-1蛋白及MUC2蛋白含量明显下降，分布不均，提示肠机械屏障遭到破坏。5-FU+益生元+益生菌组Claudin-1蛋白及MUC2蛋白含量显著提高，分布与对照组相似，表明肠机械屏障有所恢复，详见图4。

5.5-FU及益生元、益生菌对肠化学屏障的影响：对照组溶菌酶在小肠隐窝中的潘氏细胞中分布均匀，而5-FU组溶菌酶分布明显减少，肠道化学防御功能下降，增加病原菌入侵的风险，即肠化学屏障遭到破坏。5-FU+益生元+益生菌组溶菌酶含量有所回升，表明联用益生元、益生菌对5-FU作用导致的肠化学屏障损伤有一定保护作用,详见图5。

讨 论

5-FU作为临床上使用最广泛的抗癌药物之一，其药理机制通过在细胞内转变成5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5F-dUMP)与脱氧尿苷酸(dUMP)竞争性结合胸苷酸合成酶(TS)，使dUMP不能甲基化成脱氧胸苷酸(dTMP)，从而抑制细胞DNA的合成。此外，5-FU还能通过转化为5-氟尿嘧啶核苷(5-FUR)干扰RNA的正常生理功能及蛋白质的合成，抑制癌细胞生长增殖[10]。

5-FU对恶性肿瘤的治疗是把双刃剑，一方面对抑癌发挥巨大作用，另一方面对机体亦造成极大损伤。临床研究显示，5-FU化疗可带来全身毒性不良反应，包括肝、肾功能损伤、血液反应(骨髓抑制)、胃肠道反应(恶心、呕吐、腹泻)、手足口综合征、口腔黏膜炎等[5～7，11]。以往研究显示，5-FU化疗可通过以下机制引起肠机械屏障功能障碍：直接损伤肠黏膜，通过P53依赖机制引发肠上皮细胞的凋亡；影响细胞增殖周期，使受损肠上皮无法及时更新修复[1]。本研究观察到5-FU对肠黏膜损伤严重，肠紧密连接蛋白Claudin-1及黏液层黏蛋白MUC2表达均下降，即小鼠肠上皮紧密连接及黏液层均遭到损害，表明小鼠肠机械屏障在5-FU使用后受到损伤。

由于5-FU作用没有选择性，因此还可通过抑制淋巴细胞增殖，破坏肠黏膜下淋巴小结来影响肠黏膜的免疫屏障功能。据文献显示，化疗药物可同时损害体液免疫及细胞免疫[12～14]。本研究显示，5-FU作用后小鼠肠黏膜下淋巴小结分区模糊且细胞数量减少，出现空泡，CD45阳性细胞数大大减少，表明其免疫细胞遭到5-FU杀伤破坏。此外，因之前的文献鲜少探讨化疗对肠道溶菌酶的影响，故本研究还探究了5-FU对溶菌酶的影响，发现其亦可通过减少溶菌酶的分泌造成肠化学屏障的损伤，填补了化疗损伤研究中的部分空缺。

5-FU化疗造成的肠屏障损伤一方面会减少肠黏膜有效吸收面积引发吸收障碍并由此造成腹泻，另一方面则可引起肠通透性增加以及菌群失调，因此，对5-FU化疗引发的肠屏障损伤防治就尤为重要[15]。益生菌可通过如下机制实现对肠屏障的保护作用：①定植拮抗作用；②促进肠上皮紧密连接蛋白的表达；③提高肠道免疫功能以及促进抗癌物质诱发，诱导癌细胞凋亡。益生元则可刺激益生菌的生长，并改善肠道吸收功能，预防腹泻[16]。本研究观察到联用益生元、益生菌后肠组织结构得到改善，同时紧密连接蛋白Claudin-1及黏蛋白MUC2含量均提高，表明肠紧密连接及黏液层都得到较好恢复，并且CD45、溶菌酶含量的升高也表现免疫功能、化学防御功能得到改善。

综上所述，临床上由于个体差异的存在，机体对化疗药物的敏感度不一，未来的研究方向应继续寻找并研发可降低全身毒性不良反应的化疗药物以及对其造成的损伤采取干预措施。