直投式与自然发酵酸菜挥发性成分的研究

方炎鹏 张双双 蔺 冀

（1 统一企业（中国）投资有限公司 上海200335 2 统一企业（中国）投资有限公司大陆研究所 江苏苏州215300）

酸菜[1]、榨菜[2]、雪里蕻[3]及萝卜干[4]等发酵蔬菜制品是我国传统的蔬菜加工品，因其独特的风味而在我国及日本等国具有广阔的消费市场[5]。发酵蔬菜制品在加工过程中因其原料、产地、加工工艺不同，故产生的重要挥发性成分也不同。榨菜、萝卜干、酸白菜[6]等发酵蔬菜制品已有企业通过直投式菌种加快蔬菜的发酵成熟，确保产品的稳定性和一致性。采用直投式发酵剂进行萧山萝卜干的发酵，与自然发酵相比，其挥发性成分的种类、数量和含量均超过自然发酵的萧山萝卜干。直投式菌种发酵四川泡菜，酯类等挥发性成分种类及相对含量接近，感官品评无显著性差异。针对酸菜、榨菜、雪里蕻等蔬菜制品，研究人员对自然发酵过程中的优势菌群进行分析[7]、菌种筛选[8]、鉴定等[9]研究。目前因生产受限于环境条件而未采用直投式菌种发酵蔬菜。截至发稿前，对两者挥发性成分差异的研究较少。本文以酸菜为原料，采用固相微萃取与气-质谱联用技术（SPME-GC/MS），分析3种直投式菌种与自然发酵工艺中盐渍酸菜和二次发酵阶段酸菜的挥发性成分种类和含量的差异，为确定直投式菌种发酵酸菜产品的品质评价指标提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

参考文献[10]的方法制备酸菜，分别取自然发酵盐渍菜（KB）、直投式菌种-A（KHS，科汉森（中国）有限公司）、直投式菌种-B（SH，生合生物科技有限公司）和直投式菌种-C（GFJ，四川高福记生物科技有限公司） 发酵酸菜及二次发酵对应的酸菜样品备用。

1.2 仪器与设备

气-质谱联用仪 （Varian Saturn 2000 & GC 3800），美国Varian 公司；573000-U 型固相微萃取手柄、固相微萃取探头（50/30 μm 聚丙烯酸酯萃取头），美国Supelco 公司。

1.3 取样方法

称取绞碎的4.00 g 样品置于5 mL 微量萃取瓶中，采用固相微萃取法于50 ℃萃取35 min，用固相微萃取手柄将探头送入萃取瓶中，推出探头，使探头置于样品的上部，暴露30 min。

1.4 仪器分析条件

图1 酸菜盐渍/二次发酵工艺流程Fig.1 Salting/secondary fermentation process of pickled

色谱条件：30 m×0.25 mm×0.25 μm DBWAX色谱柱；炉温250 ℃，不分流进样；载气为He，流速1.0 mL/min；升温程序，从40 ℃以5 ℃/min 升温到60 ℃，然后以6 ℃/min 升温到140 ℃，最后以8℃/min 升温到230 ℃，并保持6 min；FID 检测器，检测温度260 ℃。质谱条件：70 eV EI 源，离子源温度200 ℃；250 ℃进样；扫描范围33～450 u，扫描时间35 min。

1.5 数据处理

挥发性物质经计算机检索与MAINLIB、NISTDEMO、REPLIB 和WILLEY 等4 个谱库确认定性，且各化合物峰面积的计算由软件系统经归一化计算完成，以相对峰面积的大小表示各组分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 盐渍段和二次发酵段酸菜的挥发性物质检测

传统酸菜加工过程中盐渍段和二次发酵段的样品挥发性成分的GC-MS 图谱如图2所示。各成分及相对含量见表1和表2。

图2 盐渍与二次发酵酸菜中挥发性成分的色谱图Fig.2 Chromatography of volatile compounds during processing of pickled and secondary fermentation

发酵酸菜挥发性成分的来源一般有2 种途径：一是新鲜芥菜发酵中挥发性前体物质的转化，如氨基酸及纤维素的降解等；二是添加生鲜、香辛料、白酒可为酸菜二次发酵提供复合型的挥发性成分[11]。盐渍段和二次发酵段酸菜的风味物质经GC-MS 联机分析后，各组分质谱经计算机谱库检索，检测出的挥发性物质主要包括烯类、醇类、醛类、酯类、挥发性酸和茴香精油类等6 类。

2.1.1 盐渍阶段直投式菌种与自然发酵酸菜挥发性成分的相对含量 由表1可知，盐渍段直投式菌种与自然发酵酸菜均能检测到乙酸乙酯、乳酸乙酯、异硫氰酸烯丙酯、辛酸乙酯4 种挥发性酯类，而直投式菌种与自然发酵方式的盐渍酸菜差异较小，说明盐渍段酯类物质的形成不局限于乳酸菌的作用[12]。整体而言，采用不同乳酸菌菌剂对芥菜进行盐渍后的总体香气风味物质排序为：KHS＞GFJ＞SH＞KB（空白对照），添加乳酸菌发酵后总体香气均比空白对照的含量高，说明直投式菌种与自然发酵在盐渍段整体风味物质相比无显著性差异。具体特征性风味物质属于乙酸乙酯、α-蒎烯、异硫氰酸烯丙酯及挥发性有机酸。

表1 盐渍段直投式菌种与自然发酵酸菜挥发性成分的相对含量（%）Table 1 Relative content of volatile compounds during processing of pickled （%）

（续表1）

2.1.2 二次发酵阶段直投式菌种与自然发酵酸菜挥发性成分的相对含量 由表2可知，二次发酵段直投式菌种与自然发酵酸菜相较于盐渍段除均能检测到乙酸乙酯、乳酸乙酯、异硫氰酸烯丙酯、辛酸乙酯4 种挥发性酯类外，增加了大量的d-苧烯、γ-松油烯，整体挥发性成分53 种（盐渍段酸菜挥发性成分47 种），说明二次发酵时酸菜的挥发性成分种类及相对含量均有显著提升，尤其是SH和GFJ 直投式菌种发酵酸菜在挥发性成分的相对含量与种类均比自然发酵更具优势，这点在泡菜中采用直投式菌种也得到相同结论，直投式菌种发酵泡菜与自然发酵对比无显著性差异，品质更稳定[13-14]。整体而言，采用不同乳酸菌菌剂对盐渍酸菜进行二次发酵后的总体香气风味物质排序为：SH＞GFJ＞KB（空白对照）＞KHS，添加SH 和GFJ乳酸菌发酵后总体香气均比空白对照组的含量高，说明直投式菌种对盐渍酸菜进行二次发酵，使得挥发性成分更丰富。具体特征性风味物质属于乙酸乙酯、α-蒎烯、异硫氰酸烯丙酯、挥发性有机酸及茴香精油类化合物。

表2 二次发酵段直投式菌种与自然发酵酸菜挥发性成分的相对含量（%）Table 2 Relative content of volatile compounds during processing of secondary fermentation （%）

（续表2）

2.2 直投式菌种与自然发酵酸菜挥发性成分差异性评价

不同区域、不同工艺的蔬菜发酵后风味也存在差异，在发酵蔬菜工业化中，配方及工艺参数是品质稳定的基本保障[15-16]，传统采用二次发酵方式将风味进行重新修饰与平衡。盐渍段和二次发酵段酸菜各类挥发性成分的相对含量分别见图3和图4。从图3可以看出，直投式菌种与自然发酵酸菜挥发性成分中烯类、醇类、醛类、酯类、挥发性酸和茴香精油类化合物的种类差异不大。然而，将盐渍菜采用直投式菌种与自然发酵方式进行二次发酵，由于加入少许香辛料、白酒、大蒜进行发酵，因此在二次发酵时酸菜的挥发性物质增加了二烯丙基硫醚、乙酸芳樟酯、α-松油烯、大茴香酸甲酯，而且茴香醇含量明显提高。二次发酵后挥发性物质总量相对显著增加，其中A（KHS 菌）样品发酵的酸菜挥发性物质含量最高达105 668.1 ppb，增加了98 635 ppb 的挥发性物质。同时C（GFJ 菌）样品的挥发性物质也对应增加了72 488 ppb，说明二次发酵时通过微生物与香辛料、白酒的相互作用，能在一定程度上起到提香的效果，对酸菜产品的风味及品质稳定性起到重要作用。

图3 盐渍段酸菜挥发性成分的相对含量Fig.3 Relative content of volatile compounds during processing of salted pickle

图4 二次发酵段酸菜挥发性成分的相对含量Fig.4 Relative content of volatile compounds during processing of secondary fermentation

3 结论

在酸菜盐渍阶段，直投式菌种发酵酸菜与自然发酵酸菜挥发性成分差异不显著，3 种直投式菌种发酵酸菜总挥发性成分高于自然发酵酸菜；而在二次发酵阶段，直投式菌种A（KHS）发酵样品在感官香气评分和挥发性成分总量均低于自然发酵酸菜，而直投式菌种B（SH）和直投式菌种C（GFJ） 发酵酸菜挥发性成分显著高于自然发酵酸菜。酸菜盐渍阶段主要挥发性物质为乙酸乙酯、α-蒎烯、异硫氰酸烯丙酯及挥发性有机酸，而在二次发酵过程中，酸菜中酯类及醇类物质含量有所增加，挥发有机酸种类更加丰富，大幅增加了茴香性精油的含量。在酸菜盐渍发酵阶段和二次发酵阶段分别检测到挥发性物质47 种和53 种，挥发有机酸、酯类、醇类和烯类是酸菜中最重要的挥发性成分，可作为未来直投式菌种发酵酸菜品质评价指标。