大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子单克隆抗体的制备与鉴定

王 耀 李燕虹 吴佳蓓 邢云瑞 曹金博 陈秀金 李兆周 邓瑞广 胡骁飞*

（1 河南科技大学食品与生物工程学院 食品加工与安全国家级实验教学示范中心 河南洛阳471023 2 河南省农业科学院 河南省动物免疫学重点实验室 郑州450002）

大豆富含蛋白质、脂肪和碳水化合物等物质，可为机体提供丰富的营养，是非常重要的食用蛋白、油脂及饲料来源[1]。大豆中也存在一些致敏蛋白和抗营养因子 （Antinutritional factors，ANF）[2]，胰蛋白酶抑制因子（Trypisin inhibitor，TI）是其中重要的一类。TI 可引发过敏反应，也可抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，影响消化吸收，阻碍机体生长[3-4]。TI 主要包括2 种类型[5]：一种是Kunitz 胰蛋白酶抑制因子 （Kunitz trypsin inhibitor，KTI），分子质量为20～25 ku，主要作用于胰蛋白酶，可与胰蛋白酶等比例结合，不溶于乙醇，对热和酸较敏感，易失活[6]；另一种是Bowman-Birk 胰蛋白酶抑制因子（Bowman-Birk inhibitor，BBI），分子质量为6～10 ku，含有2 个独立的活性中心，又称为双头抑制因子，可与胰蛋白酶或糜蛋白酶等比例结合或与两种酶同时结合[7]，不溶于丙酮，耐热和酸且不易被酶水解，相比KTI 较为稳定[8-9]。传统检测TI 的方法属于酶化学分析法，其在灵敏度和稳定性方面存在不足，且检测结果无法区分TI 的具体类型[10]。酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 可通过特异性抗体准确识别TI，快速、灵敏分析，是近年来TI 检测方法研究的主要方向之一[11]。该方法应用于KTI 检测的研究报道较多[12-14]，而针对BBI 检测的此类研究相对缺乏。本试验旨在通过动物免疫和细胞融合，筛选制备亲和力高、敏感性好、特异性强的BBI 单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb），为ELISA等免疫学检测方法的建立提供良好的抗体基础，进而对食品及饲料中大豆致敏蛋白和抗营养因子的高效检测起到技术依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

大豆球蛋白（Glycinin）、β-伴大豆球蛋白（βconglycinin）、大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）、BBI、KTI、鼠源mAb 分型试剂、弗氏完全佐剂及不完全佐剂（FCA/FIC），美国Sigma-Aldrich公司；HAT、HT、RPMI-1640 培养基、胎牛血清、NC膜、预染蛋白Marker、羊抗鼠二抗 （GaMIgGHRP），索莱宝生物科技公司；Na2HPO4·12H2O，KH2PO4，NaCl，KCl，NaHCO3等常用试剂为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司，用于配制ELISA包被液（CBS）、稀释液（PBS）等缓冲液。

1.2 实验动物及骨髓瘤细胞

无特定病原体（SPF）级雌性BALB/c 小鼠（6～8 周龄）用于动物免疫和腹水制备。NS0 骨髓瘤细胞用于细胞融合。

1.3 动物免疫及多抗鉴定

采用背部皮下多点注射，将BBI 以50 μg/只的剂量免疫BALB/c 小鼠4 只。首次以FCA 等量混合免疫，间隔3 周，以FIA 等量混合加强免疫，共免疫4 次。免疫完成后采血，采用间接ELISA 试验测定多抗血清效价，采用间接竞争ELISA 试验鉴定多抗血清敏感性[15]。通过间接ELISA 试验测定阳性孔OD450nm（P）与阴性孔OD450nm（N）的比值，以P/N≥2.1 判定效价。采用间接竞争ELISA 试验测得抑制曲线，计算半数抑制浓度（IC50）衡量敏感性。

1.4 杂交瘤细胞株的建立

选择多抗效价高、敏感性较优的小鼠作为超免小鼠进行细胞融合[16]。将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞悬液加入细胞培养板，置于培养箱中培养约1 周后用HT 培养基半量换液。根据细胞生长状态，在培养约10 d 时取上清液，采用间接ELISA 和间接竞争ELISA 试验筛选上清效价及敏感性良好的阳性孔，采用有限稀释法将细胞生长旺盛的阳性孔亚克隆[17]，采用ELISA 试验重复筛选，以获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。

1.5 BBI mAb 大量制备

采用体内诱生腹水法制备BBI mAb，液体石蜡以0.5 mL/只的剂量腹腔注射BALB/c 小鼠，10 d 后腹腔注射已扩大培养的阳性杂交瘤细胞 （约106个）。观察到小鼠腹部显著肿胀时进行腹水采集，在5 000 r/min 条件下离心10 min 去除杂质，通过饱和硫酸铵法纯化获得BBI mAb[18]。

1.6 BBI mAb 免疫学特性鉴定

通过效价、亚型、亲和常数、敏感性和特异性等5 个方面指标对BBI mAb 的免疫学特性进行鉴定。BBI mAb 的效价采用间接ELISA 试验测定。亚型通过Sigma 鼠源mAb 分型试剂并采用间接ELISA 方法鉴定[19]。亲和常数（Ka）通过ELISA饱和法测定[20]，采用间接ELISA 试验测定不同包被质量浓度（[Ag]t、[Ag’]t）时抗体结合抗原半饱和对应的质量浓度（[Ab]t、[Ab’]t），依据Ka=（n-1）/2（n[Ab’]t-[Ab]t）计算，式中n=[Ag]t/[Ag’]t。敏感性通过间接竞争ELISA 试验建立抑制曲线并计算IC50进行衡量。特异性通过测定mAb 与其它大豆致敏蛋白和抗营养因子 （Glycinin、β-conglycinin、SBA、KTI） 的交叉反应以及Western blot 试验鉴定。交叉反应以间接竞争ELISA 试验所得交叉反应率（CR/%=BBI 的IC50/其它竞争物的IC50）衡量[21]；Western blot 试验同样利用其它大豆致敏蛋白和抗营养因子进行，聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDSPAGE）试验做一次重复，电泳后一份用于染色，另一份用于Western blot 试验转膜，转膜后先与mAb 反应，经洗涤后再与GaMIgG-HRP 反应，最后经ECL 荧光显色，并与电泳结果对比[22]。

2 结果与分析

2.1 多抗血清的鉴定

小鼠多抗血清效价测定所得OD450nm值 （3 次试验平均值）如表1所示。4 只小鼠经免疫后均产生了抗体，其中1 号小鼠免疫效果最好，多抗血清效价能够达到1∶12 800 以上，2 号和3 号小鼠多抗血清的效价均能够达到1∶6 400 以上，4 号小鼠可能因操作不当或小鼠个体差异使其免疫效果欠佳。

表1 多抗血清效价测定所得OD450nm 值Table 1 The value of OD450nm obtained from the determination of antiserum titer

将1 号、2 号和3 号小鼠多抗血清分别进行间接竞争ELISA 试验鉴定其敏感性。通过计算抑制率 （B/B0，B 为BBI 不同质量浓度的OD450nm值，B0为BBI 零浓度的OD450nm值），并与BBI 质量浓度的对数值绘制抑制曲线。BBI 对3 只小鼠多抗血清均产生了抑制，其中对1 号小鼠多抗血清效果明显，其抑制曲线如图1所示，线性回归方程为y=-0.2239x+1.158，R2=0.9802，计算可得1 号小鼠多抗血清IC50为868.58 ng/mL。

2.2 BBI mAb 的制备

选择1 号小鼠进行细胞融合，通过间接ELISA 和间接竞争ELISA 试验对细胞培养上清液进行检测。将首次筛选出的强阳性细胞转孔培养并亚克隆，最终筛选出5 株效价高、敏感性好的杂交瘤细胞，分别命名为2E1-F3，3B7-B10，7G7-D11，8D11-B2，10B2-C8，5 株细胞经过多次冻存与复苏后，仍能够稳定分泌抗体。其中3B7-B10细胞上清效价最高，敏感性最好，通过小鼠体内诱生腹水法得到3B7-B10 腹水后纯化制备BBI mAb。

图1 1 号小鼠多抗血清的间接竞争ELISA 抑制曲线Fig.1 Indirect competitive ELISA inhibition curve of NO.1 antiserum

2.3 BBI mAb 效价的测定

mAb 效价测定所得OD450nm值如表2所示，表中3 次重复试验测得mAb 效价一致，均能够达到1∶4.096×105以上，相比小鼠多抗血清以及融合细胞培养上清有很大幅度提高。

表2 mAb 效价测定所得OD450nm 值Table 2 The value of OD450nm obtained from the determination of mAb titer

2.4 BBI mAb 亚型的鉴定

将mAb 包被ELISA 酶标板，采用mAb 分型试剂，通过间接ELISA 试验，获得不同分型试剂对应的OD450nm值。如图2所示，IgG1 分型试剂对应的OD450nm值显著大于其它分型试剂对应的OD450nm值，表明mAb 的亚型为IgG1 型。

图2 mAb 亚型鉴定Fig.2 Identification of subtype of mAb

2.5 BBI mAb 亲和常数的测定

通过ELISA 饱和法绘制分别包被5 μg/mL 和1 μg/mL BBI 时mAb 与其结合的亲和常数曲线。如图3所示，以曲线顶端平缓处为结合饱和状态，得到BBI 在5 μg/mL 和1 μg/mL 包被时，mAb 与其结合的半饱和质量浓度分别为1051.82 ng/mL和774.5 ng/mL。根据亲和常数计算公式可得Ka=1.13×108L/mol，处于高亲和力抗体的Ka 范围（107～1012L/mol）[23]，表明试验所制备的mAb 具有较高的亲和力。

2.6 BBI mAb 敏感性的鉴定

间接竞争ELISA 鉴定敏感性所绘的mAb 抑制曲线如图4所示。线性回归方程为y=-0.5138x+1.4862，R2=0.973，计算可得mAb 的IC50值为83.07 ng/mL，表明mAb 具有良好的敏感性，且相比多抗血清，敏感性显著提高。

图3 mAb 亲和常数测定曲线Fig.3 Affinity constant measurement curve of mAb

图4 BBI 对3B7-B10 mAb 的抑制曲线Fig.4 Inhibitive curve for 3B7-B10 mAb to BBI

2.7 BBI mAb 特异性的鉴定

采用间接竞争ELISA 方法测定mAb 的交叉反应试验结果如表3所示，mAb 与其它大豆致敏蛋白和抗营养因子的交叉反应率均小于1%，可判定为无交叉反应。

特异性鉴定结果如图5和图6所示，图5为3B7-B10 细胞上清的特异性鉴定结果，图6为腹水所得3B7-B10 mAb 特异性鉴定结果。图5和图6中a 图均为SDS-PAGE 试验结果，b 图均 为Western blot 试验结果。图5中a、b 图对比显示细胞上清可与第3 泳道的BBI 结合，证明细胞培养产生的抗体特异性良好。图6中a、b 图对比显示mAb 仅与第5 泳道的BBI 结合，表明试验制备的mAb 特异性强。

表3 mAb 的交叉反应试验结果Table 3 The cross-reactivity test results of mAb

图5 细胞上清特异性鉴定Fig.5 Specificity identification of cellular supernatant

3 结论

图6 mAb 特异性鉴定Fig.6 Specificity identification of mAb

本试验通过BBI 免疫BALB/c 小鼠，在鉴定小鼠多抗血清效价和敏感性的基础上，选择效价和敏感性较优的小鼠进行细胞融合，成功筛选得到分泌BBI 单克隆抗体的稳定杂交瘤细胞株，并采用体内诱生腹水法制备BBI mAb，其中3B7-B10 mAb 效价达到1∶4.096×105以上，亚型为IgG1 型，IC50为83.07 ng/mL，具有较高的亲和力且特异性强，说明所制备的mAb 免疫学特性良好，为建立大豆及其制品中BBI 的免疫学检测方法提供良好的抗体基础。