发芽大豆内酯凝胶工艺优化及营养成分分析

于殿宇 陈 俊 邹丹阳 程 杰 刘天一* 李艺琳 杨 龙 王立琦*

（1 东北农业大学食品学院 哈尔滨150030 2 哈尔滨商业大学 哈尔滨150028）

豆腐是我国传统的大豆制品，是变性大豆蛋白在凝固剂作用下所产生的凝胶产物，具有营养丰富、食用方便等特点[1-2]。豆腐中含有多种人体必需的微量元素及维生素[3]。大豆蛋白质中氨基酸组成非常接近于人体所需的理想比例，被人们称为“完全蛋白质”[4]。研究表明豆腐具有预防高胆固醇和降血糖的功效，对神经衰弱和体质虚弱的人有很大益处，对高血压、冠心病等患者在治疗过程中有一定的辅助疗效[5-6]。大豆中含有多种抗营养因子，如胰蛋白酶抑制剂、血球凝集素、植酸等，这些抗营养因子会影响豆腐中营养物质的吸收和利用[7]。

大豆经发芽处理后，异黄酮和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的含量显著增加[8-9]。异黄酮具有雌激素活性，有利于治疗和预防因雌激素水平下降而引发的更年期综合症[10-11]。异黄酮还具有多种生理功能，如抗癌，抗氧化，抗衰老，预防骨质疏松等[12-14]。γ-氨基丁酸又名酪氨酸，是中枢神经系统重要的抑制性神经递质[15]，具有多种生理活性功能，现已发现有降血压，增进肝功能，延缓神经细胞衰老，增强记忆力等多种功效[16-18]。在传统豆腐生产过程中约有12%的大豆蛋白和5%的油脂以及其它营养成分在压制过程中随黄浆水流失，而内酯豆腐在制作过程中省去了压制工序，从而可以使豆浆全部凝固，保存其中大部分营养成分。葡萄糖酸-δ-内酯（GDL）本身不能使蛋白质胶凝，只有在水解后，生成了葡萄糖酸才使蛋白质胶凝，GDL 在常温下水解缓慢，而加热后能迅速分解[19]。这种特性使内酯豆腐在加入GDL 后有充足的灌装时间，凝胶生产机械化、包装化，并且容易保存和运输。本研究以发芽大豆为原料，以GDL 为凝固剂制作内酯凝胶，探讨不同发芽时间及制备条件对内酯凝胶强度及营养物质含量的影响，以确定制作发芽大豆内酯豆腐的最佳工艺，为内酯豆腐的开发提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

材料：大豆，市售；食用级葡萄糖酸-δ-内酯，安徽省兴宙医药食品有限公司。

设备：GP/TH 恒温培养箱，上海广品实验设备制造有限公司；DJ13B-D86SJ 豆浆机，九阳股份有限公司；DZDW-1000W 电热炉，兴化市骏辉电热电器厂；TA-xTZi 物性测试仪，上海瑞玢国际贸易有限公司；HWS-24 恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；SP-756 紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；HX-1800 氨基酸自动分析仪，武汉恒信世纪科技有限公司；S-3400N 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM），日本日立公司；TA.XTC-16 质构分析仪，上海保盛实业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 发芽大豆内酯凝胶制备 挑选成熟饱满的大豆，用蒸馏水洗去大豆表面的杂质，再用5 倍蒸馏水于室温下浸泡大豆8 h，沥水后将其置于培养箱（培养条件：温度25 ℃、湿度85%）内培养一段时间，使大豆发芽至一定长度，将发芽后的大豆和水以一定质量比倒入豆浆机中磨浆；将所得物质过100 目筛除去豆渣，使用电热炉加热豆浆，其间进行消泡处理，防止假沸现象的产生；消泡完毕在95～100 ℃煮沸5 min 后取出；冷却至30 ℃加入一定量的GDL 饱和溶液，混合均匀；在85 ℃下保温一定时间再将凝胶取出，并将其立即放入冷水中快速降温，冷却成型，即得到内酯凝胶。发芽时间为0 h，即为普通大豆内酯凝胶。

1.2.2 凝胶强度测定方法 将内酯凝胶样品放在物性测试仪的载物台上，采用P0.5 型探头对准试样中心，以1 mm/s 的速度压至15 mm，测定其凝胶强度。其它参数：探头直径25 mm，探头穿刺前速度3 mm/s，返回速度3 mm/s[20]。

1.2.3 营养成分含量测定 蛋白质含量：参照GB 5009.5-2016 《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》 中凯氏定氮法；脂肪含量：参照GB/T 14488.1-2008《植物油料含油量测定》；异黄酮：参考En-Ming 等[21]的紫外分光光度法进行测定；GABA：参考Guo 等[22]的方法测定。

1.2.4 扫描电镜观察 在最优结果条件下制成普通大豆内酯凝胶和发芽大豆内酯凝胶。然后将制成的样品经脱水干燥后，用导电胶带粘在扫描电镜样品台上，喷金镀膜，最后将样品转移到SEM台面上，并在5 kV 条件观察并拍照。

1.2.5 凝胶质构的测定 利用质构仪进行内酯凝胶质构分析，采用TA36 探头。测定参数为：测前速度5 mm/s，检测速度2 mm/s，测后速度3 mm/s，检测时间5 s，激发力5.0 g，记录其质构各个指标，3 次测样取平均值[23]。

1.2.6 数据分析 所有指标测定重复3 次，试验结果取平均值±标准差，数据采用Origin 7.5 进行分析和绘制。用SPSS 17.0 进行ANOVA 单因素方差分析，并采用Duncan 检验（P＜0.05）检验数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 发芽时间对内酯凝胶的影响

选择发芽时间为0，8，16，24，32 h 的发芽大豆，按豆芽∶水为1∶4（质量比），GDL 溶液添加量为0.3%，保温时间为40 min 制作成内酯凝胶，测定其凝胶强度（如图1所示）和营养物质含量（表1）。

凝胶强度是评价凝胶品质的重要指标之一，反映大豆蛋白凝胶网络结构状态，决定凝胶产品的加工质量[20]。不同发芽时间对内酯凝胶的凝胶强度的影响如图1所示，内酯凝胶的凝胶强度随大豆发芽时间的延长呈下降趋势，在0～16 h 内凝胶强度下降缓慢，而在16 h 之后凝胶强度下降加快。这可能由于发芽时间的延长，大豆中蛋白质减少及水分增加所致，大豆中蛋白质分解成小组分，为大豆发芽提供能量，导致蛋白质含量下降[24]。蛋白质浓度是凝胶形成的决定性因素之一[25]，发芽前期（0～16 h），随发酵时间延长，芽长变化不明显，即芽中含水量增加不明显，因此凝胶强度下降较缓，在16 h 后，由于芽长增加，芽内水分含量增加，导致蛋白质浓度下降较大，因此在发芽16 h后，凝胶强度下降较快。

发芽时间与营养物质含量的关系如表1所示，凝胶中脂肪含量稍有下降，这是由于一部分脂肪转化成大豆发芽时所需要的能量[26]。GABA、异黄酮含量都有明显提高，可能由于大豆在发芽过程中呼吸作用增强，使得发芽大豆内酶的种类和数量显著增加，苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL）是其中之一，PAL 是异黄酮生物合成代谢的关键酶，因此发芽大豆中异黄酮的含量有所增加[27]；大豆在发芽过程中由于谷氨酸脱羧酶活性被激活以及外界环境的刺激等各种因素都可能造成大豆内谷氨酸转化为GABA，使GABA 积累[28]。

综合比较凝胶强度和营养物质两种因素的变化趋势，当16 h 时，凝胶强度及营养物质含量都较好，因此选择16 h 为最佳发芽时间。

2.2 豆水比对内酯凝胶的影响

以发芽大豆为原料，将发芽时间16 h 的发芽大豆，按豆∶水 （质量比）1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，GDL 溶液添加量为0.3%，保温40 min 制作成内酯凝胶，测定其凝胶强度（图2）和营养物质含量（表2）。

图1 发芽时间对凝胶强度的影响Fig.1 The effect of germination time on the gel strength

图2 豆水比对凝胶强度的影响Fig.2 Effect of bean to water ratio on gel strength

表1 发芽时间对营养物质含量的影响Table 1 Effect of germination time on nutrient content

表2 豆水比对营养物质含量的影响Table 2 Effect of bean to water ratio on the nutrient content

不同豆水比与内酯凝胶的凝胶强度关系如图2所示。豆水比在1∶2～1∶4 时，凝胶强度上升，在加水量较小时（即豆水比小于1∶4），随着加水量的增加，发芽大豆在磨浆时大豆蛋白会更加充分地释放于豆浆中，使得其蛋白质浓度增加，因此内酯凝胶的凝胶强度会有所增加。在豆水比大于1∶4 时（即加水越多），虽然此时可使蛋白质充分释放，豆浆中蛋白质含量最多，然而由于过量的水使得豆浆的相对浓度下降，GDL 添加量不足以使豆浆中的蛋白质变性，没有充分形成凝胶网络，因此，导致凝胶强度显著降低。

豆水比与营养物质含量关系如表2所示，豆水比小于1∶4 时，发芽大豆研磨不充分使得营养物质残留在滤渣中，从而营养物质含量较小；豆水比大于1∶4 时，豆浆浓度降低，导致内酯凝胶中异黄酮、GABA 等营养物质含量相对下降。结合图2、表2结果，豆水比在1∶4 时最佳，凝胶强度和营养物质含量较好。

2.3 GDL 添加量对内酯凝胶的影响

以发芽大豆为原料，将发芽时间16 h 的发芽大豆，按豆芽∶水（质量比）为1∶4，GDL 添加量分别为0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，保温40 min制作成内酯凝胶，测定其凝胶强度（图3）和营养物质含量（表3）。

GDL 在豆浆中被分解成葡萄糖酸，使豆浆的pH 值逐渐下降，导致大豆蛋白在等电点附近凝聚，改变蛋白质分子的网络结构，从而影响内酯凝胶的凝胶强度。不同GDL 添加量与凝胶强度关系如图3所示，GDL 含量在0.1%～0.3%时，呈显著上升趋势；在0.3%～0.5%时，稍有降低。当GDL 添加量过少时，不足以使豆浆中的蛋白质完全凝固，从而导致凝胶强度较低。GDL 添加量升高使得豆浆的pH 值降低，蛋白质分子间的静电斥力变小，分子间的结合力增强，因此凝胶强度升高；当GDL添加量在0.3%时，豆浆的pH 值降低至蛋白质分子等电点，此时凝胶强度达到最大；当GDL 添加量继续增加，豆浆的pH 值低于蛋白质分子的等电点时，蛋白质带有正电荷，使得其分子间的斥力增大，凝胶强度下降[29]。

不同GDL 添加量与营养物质含量关系如表3所示，随着GDL 添加量的增加，pH 值逐渐下降，发芽大豆中含有的β-葡萄糖苷酶活性增强，作用于异黄酮糖苷，水解出大量异黄酮组成成分——染料木素和大豆黄素，因此异黄酮的含量会有所增加[30]。发芽大豆中谷氨酸脱羧酶的最佳pH 值为5～6，随着pH 值逐渐下降，谷氨酸脱羧酶活性增强，使谷氨酸脱羧形成GABA，导致GABA 含量增多，pH 值下降到5 以下会影响谷氨酸脱羧酶活性从而使GABA 含量下降[31]。结合图3、表3，GDL 添加量在0.3%时最佳。

2.4 保温时间对内酯凝胶的影响

以发芽大豆为原料，选择发芽时间16 h 的发芽大豆，豆芽∶水（质量比）为1∶4，GDL 溶液添加量为0.3%，保温时间为20，30，40，50，60 min 时，制作成凝胶，测定其凝胶强度（图4）和营养物质含量（表4）。

图3 GDL 含量对凝胶强度的影响Fig.3 Effect of GDL content on the gel strength

图4 保温时间对凝胶强度的影响Fig.4 Effect of coagulation time on the gel strength

表3 GDL 含量对营养物质含量的影响Table 3 Effect of GDL content on the nutrient content

表4 保温时间对营养物质含量的影响Table 4 Effect of coagulation time on the nutrient content

不同保温时间对凝胶强度的关系如图4所示，凝胶强度呈先上升之后基本保持不变的趋势，可能随保温时间的延长，蛋白质不断变性，使巯基基团以及疏水区域不断增多，形成更加紧密的网络凝胶结构，进而提高了凝胶强度。当保温时间超过40 min 时，形成凝胶网络的变性蛋白分子不再增加，因此，在保温40 min 后凝胶强度基本保持不变[5]。

不同保温时间对营养物质含量变化如表4所示，随保温时间的延长，蛋白质形成更加紧密的网络凝胶结构，使得内酯凝胶的营养成分得以保存。保温时间超过40 min 时，形成凝胶网络的变性蛋白分子不再增加，凝胶网络结构不在改变，此时凝胶网络所包裹的营养物质含量也不再增加。综上，在保温40 min 后，凝胶强度基本不变，且时间延长会消耗更多的能量，因此，40 min 为最佳保温时间。

2.5 二次回归方程的建立与分析

综合单因素试验结果，对发芽大豆凝胶的凝胶强度进行响应面优化试验，研究采用Box-Benhnken 中心组合设计，以发芽时间（A）、豆水比（B）、GDL 添加量（C）、保温时间（D）为自变量，凝胶强度（Y）为响应值，设计4 因素3 水平响应面试验，因素水平编码见表5，试验设计方案及结果见表6。

表5 因素水平表Table 5 Table of factors and levels

表6 响应面设计方案及试验结果Table 6 Design proposal and experiment result of response surface

（续表6）

利用Design Expert 8.0.6 软件对试验结果进行方差分析，结果见表7（P＜0.05 为显著项）。将试验数据进行多元回归拟合，得到发芽时间（A）、豆水比（B）、GDL 添加量（C）、保温时间（D）的回归方程为：

R=48.62+0.36A+1.78B+0.25C-1.09D+1.91AB-3.83AC+1.40AD+0.31BC+2.77BD-3.07CD-4.13A2-5.93B2-6.31C2-4.23D2。

表7 方差分析结果Table 7 The results of variance analysis

由表7可知，整体模型的F=45.33，P＜0.0001，模型极显著，表明通过回归方程可以看出因变量与所有自变量之间具有显著的线性关系，即这种试验方法是可靠的。失拟项F=3.67，P=0.1108，失拟项不显著，表明该模型选择正确，模型中的调整系数R2Adj=95.68%，说明95.68%的响应值变化可以通过模型进行解释，相关系数R2=97.84%，说明该模型与试验拟合良好。可以用此模型来分析和预测凝胶。图5分别给出了发芽时间、豆水比、GDL 添加量、保温时间的交互作用对凝胶强度的响应曲面图。

图5 凝胶强度响应面图Fig.5 Response surface of variables on gel strength

由图5可以看出，4 个变量：发芽时间（A）、豆水比（B）、GDL 添加量（C）、保温时间（D），在两两交互时，保持其中两个变量不变，随着另外两个变量的增加，凝胶强度呈先上升后下降的趋势。其中，发芽时间（A）和豆水比（B），发芽时间（A）和GDL 添加量（C），豆水比（B）和保温时间（D），GDL添加量（C）和保温时间（D）交互作用显著，对凝胶浓度的影响较大。

应用响应面优化分析方法对回归模型进行分析，寻找最优响应结果见表8。

为检验在响应面优化条件下所得结果的可靠性，验证试验得到的凝胶强度48.76 g/cm2，响应面优化的预测值与试验值之间的拟合性良好，从而证实了模型的有效性。

2.6 扫描电镜检测结果

图6为普通大豆内酯凝胶与发芽大豆内酯凝胶SEM 对比图，图6a 为普通大豆内酯凝胶SEM图，图6b 为发芽大豆内酯凝胶SEM 图。由图6a可知，普通大豆内酯凝胶的孔隙比较密集，孔的个数较多；由图6b 可知，发芽大豆内酯凝胶的孔隙稍大，孔的个数有所减少。有文献表明，凝胶的微观空间结构与凝胶强度及持水性有直接联系[32]。发芽大豆内酯凝胶的孔隙稍大，是由于发芽大豆内酯凝胶所含蛋白质含量略有下降，导致凝胶强度降低，所得结果与上述试验结果一致。虽然发芽大豆内酯凝胶比普通大豆内酯凝胶的孔隙稍大，但差异不显著，因此对内酯凝胶的凝胶强度和持水性没有显著影响。

表8 响应面优化结果Table 8 Results of response surface optimization

图6 普通大豆内酯凝胶与发芽大豆内酯凝胶SEM 对比图Fig.6 SEM comparison of soybean lipid gel and germinated soybean lipid gel

2.7 内酯凝胶的质构与营养物质测定

质构可综合反映凝胶的各项感官品质，是品评食品优劣程度的重要因素之一[33]，弹性、硬度、咀嚼性等指标越高，豆腐的保温效果越好，豆腐的断面越光滑细腻，口感越好；而黏附性越小，感官品质综合评价越好。将表8中最优条件下制作的内酯凝胶与普通大豆内酯凝胶进行TPA 测定和营养物质含量测定，见表9、表10。由表9可知，发芽大豆内酯凝胶的质构特性与普通大豆内酯凝胶感官品质相似，而发芽大豆内酯凝胶较普通大豆内酯凝胶中的异黄酮和γ-氨基丁酸含量分别提高了66.07%和208.01%。

表9 发芽大豆内酯凝胶与普通大豆内酯凝胶质构比较Table 9 Comparison of texture of germinated soybean lactone gel and normal soybean lactone gel

表10 发芽大豆内酯凝胶与普通大豆内酯凝胶营养物质含量比较Table 10 Comparison of nutrient contents between germinated soybean lactone gel and normal soybean lactone gel

3 结论

本试验考察了发芽时间、豆水比、GDL 含量及保温时间对发芽大豆内酯凝胶强度、营养物质含量的影响。在最佳工艺条件下凝胶强度为48.76 g/cm2。发芽大豆内酯凝胶与普通大豆内酯凝胶微观结构无显著差异，质构特性相近，而发芽大豆内酯凝胶较普通大豆内酯凝胶蛋白质及脂肪含量略有下降，营养成分异黄酮和γ-氨基丁酸含量均有所提高。因此，使用发芽大豆制作内酯凝胶既可有效提高内酯凝胶的营养价值还可较好的保持凝胶的相关特性。