四川石渠县犬多房棘球绦虫感染情况调查

唐天才 ， 袁东波 ， 郭 莉 ， 侯 巍 ， 莫 茜 ， 尹 杰 ， 阳爱国 ， 郝力力

(1.西南民族大学生命科学与技术学院 ， 四川 成都 610041 ； 2. 四川省动物疫病预防控制中心 ， 四川 成都 610041)

多房棘球蚴病(Alveolar echinococcosis，AE)又称泡型包虫病，是多房棘球绦虫(Echinococcosismultilocularis，EM)的幼虫泡型棘球蚴(泡球蚴)寄生在人畜体内所致的慢性人兽共患寄生虫病[1]，是影响当地社会经济发展的重要动物疫病之一。该病主要流行于北半球高纬地区、高寒地区或冻土地带[2-3]，我国是世界上多房棘球蚴病高发的国家之一，其中又以四川、青海、西藏、甘肃等省区最为严重[4]。石渠县位于四川省西北部，境内平均海拔4 000 m以上，年平均气温约1.7 ℃，属高寒地带，适合多房棘球绦虫生活。目前石渠县是我国唯一的包虫病防控试点县，由于该地区犬只数量极大，作为该地区的主要终末宿主促进了多房棘球蚴病的传播和流行，因此，对犬感染情况的调查就显得十分重要。鉴于此，本试验采用PCR方法对石渠县部分地区犬粪中多房棘球绦虫进行检测，旨在了解该地区犬感染多房棘球绦虫的基本情况，为其今后泡型包虫病的防控提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本采集 于2016年7-9月捕捉石渠县洛须镇、格孟乡、蒙宜乡、宜牛乡、起坞乡共5个乡镇的流浪犬，每个乡镇捕捉20只，共计100只。而后将其拴养，并投喂吡喹酮驱虫，收集驱虫后3 d内的犬粪。且于2016-2018年连续3年的7-9月采集上述5个乡镇的家犬粪便(由四川省动物疫病预防控制中心采集)，所有样本放入收集管-80 ℃冻存1周以上，以灭活虫卵。

1.1.2 主要试剂 粪便DNA提取试剂盒(QIAamP DNA Stool Kit)，1×TAE溶液，Trans 2K Plus DNA Maker，2×EasyTaqPCR Super Mix，琼脂糖，PCR引物合成、测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司(成都公司)完成。

1.1.3 主要器材 电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-6C型)、台式高速离心机(Eppendorf 5402 型)、Bio-Rad 伯乐梯度PCR扩增仪(PTC240型)等。

1.2 方法

1.2.1 样品DNA制备 已灭活的粪样混匀之后取大约30 mg，按照粪便DNA提取试剂盒的说明书提取基因组总DNA，放于-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR检测 本次试验参照Dinkel R[5]所用的巢式PCR方法进行检测，第1轮反应序列为：P60.for：5′-TTAAGATATATGTGGTACAGGATTAGATACCC-3′，P375.rev：5′-ACCGAGGGTGACGGGCGGTGTGTACC-3′，片段大小372 bp；第2轮反应序列为：Pnest.for：5′-ATATTTTGTAAGGTTGTTCTA-3′，Pnest.rev：5′-ACAATACCATATTACAACAATATTCCTATC-3′，片段大小251 bp，阳性产物送公司测序。

1.2.3 序列分析及感染率计算 测序结果用DNASTAR软件进行拼接分析，在NCBI中BLAST进行同源性比对。再根据检测结果计算感染率。

2 结果

2.1 PCR检测 以犬粪便DNA为模板，运用巢式PCR扩增线粒体12S rRNA基因片段，于约251 bp处出现特异性条带，与预期大小相符(图1)。

图1 多房棘球绦虫线粒体12S rRNA基因巢式PCR扩增后电泳图

2.2 犬多房棘球绦虫感染情况 调查结果如表1所示，在时间维度上，家犬多房棘球绦虫感染率呈逐年下降的趋势，其2016年、2017年、2018年的感染率分别为14.57%、7.86%、4.00%。在地理分布上，不同地点的感染率存在差异。在终末宿主上，2016年流浪犬的感染率显著的高于家犬，其总感染率分别为流浪犬35.00%、家犬14.57%。

表1 犬多房棘球绦虫感染率统计

2.3 进化树分析 所有样本测序后，经两两比对只得2条序列，分别命名为E.m.shiqu1和E.m.shiqu2，同源性为99%。2个序列在NBCI BLAST在线比对后，E.m.shiqu1与分离自德国(EU043372)、瑞士(JN175268)以及青海(KY321841)的多房棘球绦虫同源性最高，均为100%，覆盖率99%。而E.m.shiqu2与分离自波兰(KF171965)的多房棘球绦虫同源性最高，达99.60%，覆盖率99%；与分离自日本(AB243207)的多房棘球绦虫同源性为99.20%，覆盖率99%。将2个测定序列与GenBank中同源性最高的序列以及国内外不同地点的多房棘球绦虫序列，构建进化树。如图2所示，2个分离株与国内外不同时间、不同地点分离到的多房棘球绦虫位于同一大支，亲缘关系近；与分离自四川的细粒棘球绦虫(E.g.JN981128)不在同一大支，亲缘关系远。

图2 基于12S rRNA构建的多房棘球绦虫进化树

3 讨论

目前，检测犬粪中多房棘球绦虫的方法有犬粪抗原ELISA方法和分子生物学方法[6]。前者虽有操作简单、快捷、对试验设备要求简单、应用范围广等优点，但仍具有一定的缺点：首先与亲缘关系较近的细粒棘球绦虫易发生交叉反应，使其特异性降低；再者此方法的敏感性与虫体负荷量有关，当虫体数量较少时不易检出，易发生漏检现象。Raoul等[7]利用粪抗原-ELISA技术检测多房棘球绦虫感染狐狸的粪抗原时，认为其敏感性与虫体负荷有关，当虫体数为1～25条时，此方法的敏感性为(31.1±8.64)%，当虫体数>50条时敏感性为(81.8±0.66)%，当虫体数>100条时敏感性可达(100±0.34)%。本次调查所用的巢式PCR方法，通过两轮反应克服了单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大地提高了PCR的敏感性。Dinkel等[5]应用巢式PCR对狐狸粪便进行检测，其敏感度可达对1个虫卵的检测。其次第2轮反应引物和模板的改变，降低了非特异性反应连续放大的可能性，保证了反应的特异性。

调查结果显示，石渠县流浪犬多房棘球绦虫的感染率为35%，与2000年黄燕等[8]对甘孜县流浪犬调查的感染率34.8%(8/23)相近，说明长期以来甘孜州流浪犬可能处于较高的感染水平；此外，在2016年流浪犬的感染率显著的高于家犬。以上2个现象可能是因为流浪犬食性杂、食谱广，从未驱虫；其次流浪犬与野生啮齿动物在同一环境中生存，势必会发生流浪犬捕食野生啮齿动物的现象，从而导致多房棘球绦虫的野生循环，这也是流浪犬的感染率居高不下的最重要因素。反之高感染率的流浪犬又增加了环境污染的机会，给当地牧民带来了较高被感染的风险。另外，在本调查中5个地区家犬与流浪犬的感染率存在较大差异，正如刘辉等的报道[9]：多房棘球绦虫的分布在较小的地域范围内也有很大差异，可能与中间宿主啮齿类动物在不同生态环境中的分布差异有关。据调查石渠县有野生啮齿类动物近13亿只，但分布不均，在纯牧区的草原地带分布密集，而在半农牧区的高山峡谷带分布则相对稀疏，这也是位于半农牧区的洛须镇家犬与流浪犬的感染率均是最低的原因之一。

家犬的感染率下降，说明近几年在有关部门的防控力度不断加大以及以“双灭源”、“三切断”、“八举措”为主的“238”高寒藏区畜间包虫病防控新模式[10]取得了显著的成效，但由于石渠县面积大、野生动物种类及数量多、环境复杂，所以形势依然严峻，需持续监测。此外，还应继续做好犬只的驱虫和管理工作，从而更加切实有效的防控泡型包虫病。