多重连接探针扩增和二代测序技术检测Duchenne型肌营养不良基因分析

何展文 陈启慧 李平甘 吴若豪 李栋方 李 宇 周小琳 罗向阳

中山大学孙逸仙纪念医院，广东 广州 510120

Duchenne型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是X连锁隐性遗传性致死性肌肉病，发病率(15.90～21.90)/10万活产男婴，临床表现包括行走和蹲起困难、缓慢进展的全身骨骼肌无力和肌萎缩，小腿腓肠肌假性肥大、坚实，Gowers征阳性，多于9～12岁丧失行走能力[1]。DMD致病基因位于X染色体短臂-Xp21，包含79个外显子，编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)[1-2]。抗萎缩蛋白的分子量为427 kD，是一种细胞骨架蛋白，位于肌膜的内侧，其氨基端与肌动蛋白连接，羧基端与肌膜的糖蛋白复合物结合，对维持细胞膜的稳定，防止细胞坏死起重要作用。DMD基因突变导致表达产物dystrophin缺失或明显缺乏，引起肌细胞膜结构缺陷，可使细胞内成分如肌酸激酶逸出，细胞外的钙离子过多流入肌纤维，造成肌纤维的慢性进行性变性、坏死、再生、萎缩等一系列的病理生理变化。至今DMD仍无有效治疗手段，临床上多采用口服糖皮质激素类，辅以营养支持、康复训练和呼吸支持等多学科管理改善疾病症状，但并不能改变疾病的最终结局。随着基因治疗的不断发展和基因组编辑技术的不断进步，从DMD的致病基因着手，有望为DMD的治疗带来新的希望。目前国内外检测DMD基因突变的主要方法是多重链接探针扩增技术(MLPA)，但该检测方法只能检出DMD基因大片段缺失和重复突变，不能检测点突变[3]。随着二代基因测序检测技术的发展和应用，二代测序可以检测DMD基因点突变、微小缺失或插入突变等突变，更好地弥补了MPLA检测不足[4]。本研究探讨联合应用MLPA和二代基因测序技术对DMD遗传学诊断的作用，为DMD的精准诊治和指导优生优育提供遗传学依据[5]。

1 对象和方法

1．1研究对象收集2012-01—2019-12在中山大学孙逸仙纪念医院儿科神经专科临床诊断假性肥大型肌营养不良的住院儿童59例，均为男性患儿，就诊年龄为11个月～15岁，平均4.72岁。临床诊断依据：(1)男性患儿，运动能力异常，以双下肢进行性近端肌无力、小腿腓肠肌假性肥大为主；(2)血清肌酸激酶(CK)明显升高至正常值的10～50倍。本研究获得患儿家长知情同意，同时获中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会批准。

1．2方法

1．2．1 外周血DNA提取：抽取所有患者及部分家系成员外周静脉血2 mL，2% EDTA抗凝。采用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，德国)提取外周血DNA，按照说明书进行。

1．2．2DMD基因MLPA技术检测：DNA样品(50～200 ng)，98 ℃加热5 min后冷却到25 ℃，分别加入P034-A2/P035-A2探针(MRC-Holland，荷兰)和MLPA buffer，混匀，95 ℃孵育1 min，60 ℃杂交16 h。杂交后将温度降至54 ℃，加入Ligase-65混合物，54 ℃孵育15 min，98 ℃加热5 min。将连接产物加入SALSA PCR引物，按照以下PCR程序扩增：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 20 min。将PCR产物置于分析仪上进行毛细管电泳，最后进行数据收集及分析。

1．2．3DMD基因测序：根据UCSC数据库中提供的DMD基因序列(NM 004006.2)，设计PCR引物，扩增片段包括DMD基因5’端启动子区域、79个外显子和3’端下游部分碱基，共86个片段。PCR扩增：反应总体积为10 μL，包括正向引物(100 ng/μL)0.2 μL、反向引物(100 ng/μL)0.2 μL、DNA模板(100 ng/μL)0.2 μL、Taq酶预混液5 μL和ddH2O 4.1 μL。扩增条件：先95 ℃预变性11 min，然后95 ℃ 60 s，62 ℃ 35 s(以后每个循环降低1 ℃和延长2 s)，72 ℃ 100 s×10个循环，接着(95 ℃ 60 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s)×25个循环，再65 ℃ 20 min，4 ℃保存。测序与结果分析：用虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ处理扩增好的PCR产物，37 ℃孵育120 min，80 ℃ 15 min灭活虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ，上机测序。测序结果与标准序列进行比对分析，参照标准命名法命名所有微小突变。

2 结果

2．1临床表现所有患儿均表现为运动功能异常，近端肌无力为主，肌张力低下，小腿肌肉假性肥大。血清肌酸激酶(CK)显著升高(14 466±7824)U/L，肌酸激酶同工酶(CK-MB)中度升高(376±208)U/L。

2．2DMD基因MLPA分析59例患儿中28例(47.46%)为DMD外显子缺失突变，7例(11.86%)为DMD基因外显子重复突变，24例(40.67%)未检出基因外显子缺失或重复突变。7例DMD基因中有6种单外显子缺失，分别涉及外显子1、44、48、49、51和52，22例有多个外显子缺失。图1显示DMD基因每个外显子的缺失频率情况。横坐标显示DMD基因第1-79外显子的外显子数目；纵坐标显示每个外显子的缺失频率。根据DMD基因缺失总的分布频率，在第45-55外显子区域缺失频率最高。

图1 DMD基因外显子的缺失频率Figure 1 Frequency of exon deletion of DMD gene

2．3DMD基因微小突变分析利用基因测序检测24例MLPA阴性患者与肌营养不良相关的微小突变，共检出23例(38.98%)微小突变，其中包括无义突变8例(13.55%)，移码突变6例(10.17%)，错义突变6例(10.17%)，微缺失3例(5.08%)。Sanger测序用于验证患者和携带者中潜在的致病性小突变。所有23个微小突变中，均分布在不同外显子区域，未发现点突变和微缺失热点区。

应用MLPA和第二代测序检测1例患儿未发现外显子缺失或重复、微小突变，该患儿通过肌肉病理检查显示肌纤维大小明显不等，小纤维多为圆形或多边形，可见较多肥大及劈裂纤维，可见小群灶状分布的坏死伴吞噬及再生纤维，肌间质结缔组织明显增生，肌间质未见炎症细胞；肌纤维膜Dystrophin-Rod/C/N表达普遍完全消失，临床病理确诊。

3 讨论

DMD是儿童期最常见的致死性遗传性肌肉病，是肌细胞膜上骨架蛋白抗肌萎缩蛋白(dystrophin)缺失所致，临床表现为进行性肌无力和肌萎缩，并最终死于心力衰竭或呼吸衰竭[1]。随着基因技术的发展和可用性，肌肉活检诊断已逐渐被基因检测所取代，基因检测已成为DMD最新诊治指南中的新金标准[6]。近年来基因治疗进展能从DMD疾病发生的根源着手，为DMD患儿的带来新的治疗希望。

人类DMD基因位于Xp21.1 区域，全长约2.4 Mb，包含79个外显子和78个内含子，是目前已知的人类最大的基因。DMD基因突变大致可分为三类：外显子缺失或重复突变、微小突变(包括碱基的置换、重复、缺失或插入)和剪切区突变[2]。MLPA作为一种高通量、针对基因序列进行定性和半定量分析的快速、简单、可靠检测手段，可以作为DMD基因检测缺失/重复的一线筛查方法[7]。本研究运用MLPA技术检测58例DMD患儿DMD基因，缺失突变47.46%，重复突变11.86%，点突变39.66%，缺失热点区域为外显子45-55。既往研究显示，DMD基因缺失突变占55%～65%，重复突变占5%～15%，点突变占35%，而热点缺失区分别在外显子45-53的中央区和外显子2-20的5’端[7-9]。本研究结果与国外报道基本相符，提示DMD基因突变类型及缺失分布规律并无明显种族区别。外显子跳跃治疗是DMD研究最多的基因治疗方法，研究显示该治疗具有较好的临床应用前景[10]。DMD基因突变热点位于外显子45-55，因此，针对外显子51的跳跃治疗是最高适用比例的跳跃治疗方法，也是最早进行临床试验的外显子跳跃治疗方法。目前开展临床试验阶段的外显子51跳跃治疗药物是Drisapersen和Eteplirsen，两者化学不同，Drisapersen的主要成分是2’O-甲基-硫代磷酸酯寡核苷酸(2’O MePS)，Eteplirsen是磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)。从已公布的临床试验结果可以看出，二种药物虽有疗效但并不显著，且仅适用于特定类型的突变患者[11-14]。但随着对外显子跳跃治疗药物的研发，相信越来越多的患者会从中获益。

本研究通过二代测序技术检测出39.66%患儿发生DMD微小突变，其中13.55%为无义突变，10.17%为移码突变，10.17%为错义突变，5.08%为微缺失，并未发现微小突变发小最多的外显子区域。无义突变由于碱基的改变导致终止密码子(PTCs)提前出现，使肽链合成提前终止，产生截短的、通常没有正常功能的蛋白产物。PTC124是目前研究较多的无义突变通读治疗口服药物，最初经高通量药物筛选鉴定并由美国PTC Therapeutics公司研发获得，可以通过与核糖体亚基结合忽视无义突变产生的终止密码子，使细胞产生全长而有功能的抗肌萎缩蛋白[15]。目前从该药在国内外多个临床试验治疗效果来看，其对DMD具有一定的治疗作用，但更多的临床终点评价和长期治疗效果尚待进一步随访和观察[16-17]。

此外，本研究中1例患儿应用MLPA和第二代测序检测未发现外显子缺失或重复、微小突变，该患儿最终通过肌肉病理检查临床确诊为DMD。基因检测技术能在基因水平上明确DMD诊断，但由于检测技术水平等因素限制，或某些复杂突变和内含子突变，仍有极少临床病例需要结合病史和肌肉病理从蛋白质水平明确临床诊断。

总之，联合应用MLPA和二代基因测序技术是明确DMD致病基因突变位点最佳策略，能为DMD患儿的提供更加精准诊治和家系成员的遗传咨询提供准确的依据，更好地避免患儿的出生，提高优生优育效果。