脓毒症相关性脑病老年小鼠的脑转录组分析

徐震亚 郭 铁 徐 娜 李宏宾 冯 敏 孙荣青

郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052

脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy，SAE)是伴随脓毒症发生的，在无直接的中枢神经系统感染、结构异常或其他类型脑病(如肝或肾性脑病)的情况下，出现弥漫性脑功能障碍[1]。SAE 通常表现为从嗜睡到昏迷程度不等的意识障碍，常伴有谵妄，注意力下降，思维混乱，其他症状还包括幻觉、睡眠节律异常和躁动，而且谵妄常出现于脓毒症早期，对脓毒症的早期诊断也是很有意义的线索[1]。关于SAE 的发病率，研究结果存在很大差异，为9%～71%，这与各研究采用的诊断标准不同有关[2]。研究显示重症监护病房中脓毒症相关性脑病的发生率为17.7%[3]。患有菌血症且被诊断出患有肾、肝或多器官功能障碍的患者，SAE 的发生率更高。一旦患者出现SAE，则预示着其与普通患者相比，具有更高的病死率，更多的重症监护资源占用和更长的住院时间[4]。而SAE的发生，在老年患者中更为普遍[5]。因此，对老年SAE 进行研究，对降低老年脓毒症患者的病死率，减少相关医疗费用具有重要意义。老年脓毒症患者SAE的发病机制仍不清楚，目前研究显示可能与内皮激活、血脑屏障改变、神经递质改变等有关[6]。推测老年SAE患者与成年SAE患者的病理机制存在差异，对两者进行脑组织转录组的分析，具有重要意义。但人脑组织样本的获取存在很大困难。从National Center for Biotechnology Information(NCBI)的Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中发现，GODBOUT等[7]上传的数据集GSE3253包含了老年和成年小鼠的脑组织基因表达芯片的数据，但并未对其进行生物信息学分析。因此，对该数据集进行了进一步生物信息学分析，以期发现老年SAE小鼠与成年SAE小鼠相比，其病理过程中独特的关键基因及通路，来为进一步的研究指明方向。

1 芯片数据

数据集GSE3253来自于GEO数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE3253)。由于数据来自于公共数据库，因此不需要伦理学审批。该数据集由 GODBOUT等[7]上传，他们采用腹腔注射LPS的方法制作SAE动物模型[8-9]，研究包括成年组小鼠3只和老年组小鼠3只，采用[Mouse430_2]Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array平台进行基因表达分析。该研究设计严谨，数据详实，但无进行充分的生物信息学分析。

2 方法

2．1差异基因的筛选使用GEO提供的GEO2R在线工具(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE3253)进行基因差异表达分析。GEO2R是GEO提供的基于R语言软件包的在线分析工具[10]。首先通过value distribution功能对芯片数据表达值的可比性进行分析；设置P<0.01，同时|Log2Fold change|>1.5为筛选差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)的阈值。对于无基因注释的探针位点数据，我们将其删除；对于一个位点同时对应多个注释基因的数据，我们将其删除；对于同一基因对应多个探针位点数据的，我们保留P值最小的数据，其余数据删除。

2．2基因本体论富集分析将得到的上调和下调的DEGs分别上传至DAVID网站(https：//david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)进行基因本体论(Gene ontology，GO)分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

2．3KEGG通路富集分析将得到的上调和下调的DEGs分别上传至DAVID网站(https：//david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2．4蛋白互作分析将得到的全部DEGs上传至STRING网站(https：//string-db.org/cgi/input.pl)进行蛋白互作分析。设置confidence score=0.7，将得到的蛋白互作数据使用cytoscape(version 3.5.1)进行可视化制图。

3 结果

3．1DEGs的筛选通过差异表达基因的筛选，共筛选到305个DEGs，其中上调DEGs为157个，下调DEGs为148个。表1中分别列出了根据P值排列的前10个上调和下调的DEGs。可以发现，这些上调的基因与恶病质、脂肪代谢、肿瘤进展、细胞凋亡有关[11-12]。下调基因与基质的分解组装[13]，免疫细胞的迁移，功能和存活[14]。见表1。

3．2基因本体论富集分析基因本体论包括三个分类：生物过程(Biological process，BP)，细胞成分(Cellular component，CC)，和分子功能(Molecular function，MF)。

3．2．1 Biological process：通过GO富集分析，在BP分类中，上调的157个DEGs富集到13个BPs，集中在细胞的分化、发生以及对应激的反应等；下调的148个DEGs富集到11个BPs，集中在离子转运、凋亡的调控、对脂多糖的反应等。图1A中列出了上调和下调的DEGs所富集到的前5项生物过程条目(根据P值排列)。

3．2．2 Cellular component：通过GO富集分析，在CC分类中，上调的157个DEGs富集到3个CCs，集中在细胞质、胞外区域；下调的148个DEGs富集到6个CCs，集中在胞核、胞膜和胞外区域。图1B中列出了上调和下调的DEGs所富集到的细胞成分条目(根据P值排列)。

3．2．3 Molecular function：通过GO富集分析，在MF分类中，上调的157个DEGs富集到3个MFs，集中在代谢相关的功能；下调的148个DEGs富集到8个MFs，集中离子通道活性、激素活性相关功能。图1C中列出了上调和下调的DEGs所富集到的分子功能条目(根据P值排列)。

注：红色代表上调DEGs所富集到的GO条目，绿色代表下调DEGs所富集到的GO条目

3．3KEGG通路富集分析通过KEGG通路富集分析，上调的157个DEGs富集到4个通路，包括mmu05218：Melanoma(P=0.02)；mmu04015：Rap1 signaling pathway(P=0.03)；mmu04014：Ras signaling pathway(P=0.04)；mmu05200：Pathways in cancer(P=0.04)。下调的148个DEGs富集到3个通路，包括mmu05032：Morphine addiction(P=0.01)；mmu04060：Cytokine-cytokine receptor interaction(P=0.03)；mmu04721：Synaptic vesicle cycle(P=0.04)。图2显示了KEGG通路富集分析的结果(根据P值排列)，红色代表上调通路，绿色代表下调通路。

注：红色代表上调通路，绿色代表下调通路

3．4蛋白互作网络分析通过PPI蛋白互作分析发现两个主要的蛋白互作网络，Gngt1、Sucnr1、Bdkrb2、Exo1、Cdk1是这两个互作网络中的关键基因。图3显示了主要的基因蛋白相互作用的关系。

注：椭圆形标注为基因蛋白名称，黑线代表两者间存在调节作用

4 讨论

通过对SAE的老年小鼠与成年小鼠脑组织基因表达芯片数据的对比分析发现，Gngt1、Sucnr1、Bdkrb2、Exo1、Cdk1基因可能在老年SAE发病过程中具有重要作用。

Gngt1 (log2 FC=4.22)在眼睛和大脑都有表达[15]，它参与了胰岛素抵抗途径[16]，参与了PIK3-AKT信号通路[17]，其在炎症反应过程中有重要作用。本研究中发现，相对于成年SAE小鼠，老年SAE小鼠Gngt1的表达是上调的，其会增加老年SAE患者脑损伤的发生。

SUCNR1 (log2 FC=2.86)是一种G蛋白偶联受体，在缺血、缺氧等应激反应中起重要作用。SUCNR1的激活促进了巨噬细胞的抗炎表型，并增强了这些细胞对白介素4等的反应，在巨噬细胞的抗炎反应中具有关键作用[18]。巨噬细胞中SUCNR1的激活对于肥胖者脂肪组织的浸润和炎症均很重要，并且表明SUCNR1是肥胖诱导2型糖尿病有希望的治疗靶标[19]。另外，SUCNR1在肾素诱导的高血压，局部缺血/再灌注损伤，炎症和免疫反应，血小板聚集和视网膜血管生成中也具有重要作用[20]。LUKYANOVA等[21]研究发现，SUCNR1相关的信号通路对大脑缺氧耐受形成有重要作用。一次低氧暴露，会在15～60 min内诱导SUCNR1在大脑皮层中表达，这与对机体缺氧的紧急耐受性形成有关。缺氧期间，脑皮质特异性SUCNR1的即时表达与GABA旁路的活性有关。Sucnr1具有抗炎和促进大脑对缺氧的耐受作用，相对于成年SAE患者，老年SAE患者Sucnr1表达的升高具有保护作用。

BDKRB2(log2 FC=3.48)可以增加血脑屏障通透性[22]，在中枢神经系统免疫反应中起重要作用[23]。BDKRB2对完整激肽具有高度亲和力，激肽介导广泛的生物学作用，包括疼痛、炎症、血管舒张以及平滑的核收缩和松弛[24]。缓激肽是激肽的一种，优先结合BDKRB2，可以在早期阶段通过内皮细胞中的BDKRB2受体增加血管通透性，并通过在基质细胞中BDKRB2受体在后期阶段促进血管内皮生长因子(VEGF)的上调来促进血管生成。本研究发现老年SAE小鼠Bdkrb2表达较成年SAE小鼠显著升高，说明其对血脑屏障的破坏作用在老年SAE发生中有更重要的作用。

EXO1(log2 FC=3.53)是一种5'→3'核酸外切酶，有助于调节细胞周期检查点，维持DNA修复途径，它的缺乏会导致DNA双链断裂，细胞周期停滞，细胞死亡或细胞转化。EXO1在保护基因组稳定性中起到重要作用[25]。结合本研究，老年SAE小鼠对基因组稳定性的保护优于成年SAE小鼠。

Cdk1(log2 FC=-2.64)在神经元受损后表达上调，初级皮层神经元培养物暴露于氧葡萄糖剥夺(OGD)4 h会导致神经元细胞死亡并诱导Cdk1表达。Cdk1敲除的小鼠神经元显示出对OGD诱导的神经元细胞死亡的部分抗性[26]。老年SAE小鼠Cdk1表达较成年SAE小鼠显著升高，导致老年SAE神经元细胞死亡增加。

研究发现炎症和血脑屏障的破坏在老年SAE的发病中起到了关键作用，Gngt1、Sucnr1、Bdkrb2、Exo1、Cdk1基因可能在老年SAE发病过程中具有重要作用，这为进一步对老年SAE发病机制的研究指明了方向。本研究的缺点在于芯片数据的样本量较小，而结果是基于对既往研究数据的分析得到的，由于临床中脑组织样本获得存在极大困难，而血脑屏障的存在，脑组织中蛋白水平的变化与血液中蛋白水平的变化并不一致，会在进一步的研究中对这方面的缺陷进行改进。