人脑膜瘤中ATF3 maspin和MMP2表达研究

马斯奇 孙逸杰 朱旭强 李雪元 吴立新 闫东明

郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052

脑膜瘤是常见的中枢神经系统原发性肿瘤，世界卫生组织(WHO)将脑膜瘤分为三级，Ⅰ级为良性(80% 以上)，Ⅱ级为不典型(15%～20%)，Ⅲ 级为恶性(1%～3%)[1]。大多数脑膜瘤为良性，临床预后较好[2]，然而对于恶性脑膜瘤，治疗效果差，预后差，易复发(复发率可达80%)，中位生存期仅1～2 a，5 a内病死率约68%[3]，患者病死率、致残率明显增加[4]。脑膜瘤浸润性生长和复发的重要病理环节是细胞异常增殖与侵袭，多种增殖基因和侵袭基因异常表达[5]，但具体的分子机制仍未明确。因此，探讨脑膜瘤发生发展及侵袭、转移的相关机制成为医学界广泛关注的焦点。本研究采用免疫组织化学法、qRT-PCR和Western blot法检测激活转录因子3(activating transcription factor 3，ATF3)、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制因子(mammary serine protease inhibitor，maspin)和基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)在正常脑组织和各病理级别脑膜瘤组织中的mRNA和蛋白表达情况，探讨ATF3、maspin和MMP2在脑膜瘤组织发生、发展、浸润、转移及预后评估中的作用，为发现新的脑膜瘤治疗靶点提供帮助。

1 材料与方法

1．1标本来源观察组选取郑州大学第一附属医院2019-01—2020-06手术切除的脑膜瘤标本71例，男33例，女38例，年龄25～69(41±2.7)岁。所有病理结果均由病理科明确诊断，Ⅰ级脑膜瘤50例，Ⅱ级15例，Ⅲ级6例(WHO中枢神经系统肿瘤2007年分类标准)。正常脑组织标本为手术切除的同期颅脑外伤病人的挫伤脑组织标本32例，男20例，女12例，年龄6～61(37.7±6.2)岁。本研究由院道德伦理委员会批准，每一位参与患者均已充分沟通并签署相关告知同意书，患者同意参加此项研究。

1．2主要试剂ATF3、maspin和MMP2兔抗人多克隆抗体、山羊抗兔IgG抗体、内参β-actin、DAB显色试剂盒、Western blot所用的组织裂解液和化学发光试剂均从美国Santa Cruz公司采购。全部PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，实时荧光定量PCR试剂盒、逆转录试剂盒和组织RNA提取试剂盒均从美国Invitrogen公司采购。

1．3实验方法

1．3．1 免疫组化：按试剂盒说明严格进行实验过程。常规组化制片、细胞爬片、梯度酒精脱水。组织切片和细胞爬片均用0.3 % H2O2甲醇溶液室温孵育30 min，0.1% TritonX-100中冰浴5 min。三个基因组织切片抗体工作浓度为1∶200，细胞爬片工作浓度为1∶100，显微镜下DAB显色。阳性染色为胞浆或胞核中出现黄色颗粒或棕黄色，以H-score(H=I×P)系统[6]为参照。每张切片取5个高倍视野(×400倍)，随机计数100个细胞，求其平均阳性率。

1．3．2 RT-PCR：严格按照说明书进行总RNA提取、逆转录PCR、实时荧光定量PCR步骤，内参为β-actin，ATF3上游引物为：5′-CCTCGGAAGTGAG TGCTTCT-3′，下游引物为：5′-ATGGCAAACCTCAGCTCTTC-3′；maspin上游引物为：5′-AGACATTCTCGCTTCCCTGA-3′，下游引物为：5′-AATTTTGACC CCTTATGGGC-3′；MMP2上游引物为：5′-GCTATGGACTTGGG AGAA-3′，下游引物为：5′-TGGAACGGAATGGAAAC-3′。实时荧光定量PCR反应条件为：95 ℃，5 min，循环条件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min共40个循环。参照LIVAK等[7]的研究方法(△△CT法)，得到各组样本三个基因mRNA表达量的相对比值进行统计学分析。

1．3．3 Western blot：从-80 ℃取出组织样本，按照Western blot常规步骤进行操作，组织裂解、冰孵，两次离心，10% SDS-PAGE胶分离，半干法转膜后封闭1 h。工作浓度1∶1 000一抗4 ℃过夜后，二抗(工作浓度1∶2 000)在37 ℃条件下孵育2 h，ECL法和X线胶片曝光，扫描胶片，分析ATF3、maspin和MMP2三种蛋白与β-actin的积分光密度的比值。

1．4统计学处理数据处理采用SPSS 23.0统计软件。秩和检验比较等级资料，Mann-WhitneyU检验等级资料的两样本比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1各病理级别脑膜瘤组织和正常脑组织中三个基因免疫组化蛋白分布和表达

2．1．1 ATF3蛋白表达情况：脑膜瘤组织阳性表达率为46.5%(33/71)，正常脑组织18.8%(6/32)，P<0.043，见表1。ATF3蛋白在Ⅰ级脑膜瘤细胞呈散在分布，在Ⅱ和Ⅲ级脑膜瘤中广发分布，而微弱表达于正常脑组织中(图1)。ATF3蛋白在Ⅰ～Ⅲ级脑膜瘤组织中阳性表达与正常脑组织相比差异均有统计学意义(P<0.003 3)(表1)。ATF3蛋白表达与脑膜瘤病理分级呈正相关(ρ=0.621，P<0.041)。

图1 ATF3的表达(免疫组化 ×400)A：正常脑组织；B：脑膜瘤WHO Ⅰ级；C：脑膜瘤WHO Ⅱ级；D：脑膜瘤WHO Ⅲ级Figure 1 ATF3 expression (immunohistochemistry ×400)A：Normal brain tissue；B：Meningioma WHO grade Ⅰ；C：Meningioma WHO grade Ⅱ；D：Meningioma WHO grade Ⅲ

2．1．2 mapin蛋白表达情况：脑膜瘤组织和正常脑组织中maspin蛋白阳性表达率分别为76.1%(54/71)和93.8%(30/32)，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。细胞胞核和(或)胞浆出现棕色或浅黄色颗粒为maspin蛋白阳性表达，在正常脑组织中呈强阳性表达，在Ⅰ级脑膜瘤中多呈棕黄色，在Ⅱ和Ⅲ级脑膜瘤中多呈浅黄色，呈不均匀散在分布或弥漫分布(图2)。Ⅰ级脑膜瘤组织中maspin蛋白的阳性表达与正常脑组织相比差异无统计学意义(P>0.05)，Ⅱ和Ⅲ级脑膜瘤组织中maspin蛋白的阳性表达与正常脑组织相比差异均有统计学意义(P<0.05)(表1)。maspin蛋白表达与脑膜瘤病理分级呈负相关(ρ=-0.517，P<0.01)。

图2 Maspin的表达(免疫组化 ×400)A：正常脑组织；B：脑膜瘤WHO Ⅰ级；C：脑膜瘤WHO Ⅱ级；D：脑膜瘤WHO Ⅲ级Figure 2 Maspin expression (immunohistochemistry ×400)A：Normal brain tissue；B：Meningioma WHO grade Ⅰ；C：Meningioma WHO grade Ⅱ；D：Meningioma WHO grade Ⅲ

2．1．3 MMP2蛋白表达情况：脑膜瘤组织阳性表达率为42.3%(30/71)，正常脑组织为12.5%(4/32)，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。肿瘤细胞胞浆出现棕色颗粒视为MMP2蛋白阳性表达，少量细胞核也有染色，在Ⅰ级脑膜瘤组织中呈散在分布，在Ⅱ和Ⅲ级脑膜瘤组织中弥漫分布，而在正常脑组织中无表达或微弱表达(图3)。MMP2蛋白阳性表达在Ⅰ～Ⅲ级脑膜瘤组织与正常脑组织中相比差异均有统计学意义(P<0.05)(表1)。MMP2蛋白表达与脑膜瘤病理分级呈正相关(ρ=0.564，P<0.007)。

表1 ATF3、maspin和MMP2蛋白在脑组织的阳性表达情况 [n(%)]

图3 MMP2的表达(免疫组化 ×400)A：正常脑组织；B：脑膜瘤WHO Ⅰ级；C：脑膜瘤WHO Ⅱ级；D：脑膜瘤WHO Ⅲ级Figure 3 MMP2 expression (immunohistochemistry ×400)A：Normal brain tissue；B：Meningioma WHO grade Ⅰ；C：Meningioma WHO grade Ⅱ；D：Meningioma WHO grade Ⅲ

2．2各病理级别、各级脑膜瘤组织和正常脑组织中三个基因mRNA相对定量如图4～6所示，Ⅰ～Ⅲ级脑膜瘤中ATF3 mRNA的相对表达量分别是正常脑组织的(2.12±0.17)倍(P<0.042)、(4.93±0.41)倍(P<0.039)和(6.03±0.57)倍(P<0.047)；maspin mRNA在Ⅱ和Ⅲ级脑膜瘤中maspin mRNA表达相对量分别是正常脑组织的(0.47±0.07)倍和(0.25±0.04)倍，差异均具有统计学意义(P<0.05)；在Ⅰ～Ⅲ级脑膜瘤中MMP2 mRNA相对表达量分别是正常脑组织的(1.41±0.28)倍、(3.63±0.43)倍和(5.89±0.55)倍，均P<0.05。

注：与正常脑组织相比，*P<0.05

2．3各级脑膜细胞瘤中和正常脑组织三个基因的蛋白定量检测结果如图7所示，ATF3蛋白在正常脑组织和各级脑膜瘤中均有表达，在Ⅰ～Ⅲ级脑膜瘤中的相对表达量分别是正常脑组织的(2.45±0.21)倍、(5.27±0.43)倍和(6.39±0.54)倍，均P<0.05，见图8。

图7 ATF3、maspin和MMP2在各病理级别脑膜瘤和正常脑组织中的蛋白表达情况Figure 7 Protein expression of ATF3，maspin and MMP2 in various pathological grade meningioma and normal brain tissue

在Ⅱ和Ⅲ级脑膜瘤中maspin蛋白表达量分别为正常脑组织的(0.38±0.04)倍和(0.14±0.02)倍(P<0.05)；MMP2蛋白在Ⅰ～Ⅲ级脑膜瘤中的表达分别为正常脑组织的(1.59±0.2)倍、(3.39±0.3)倍和(5.54±0.35)，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图8。

注：*、#和◆与正常脑组织相比，P<0.05

Spearman等级相关分析显示，ATF3和MMP2蛋白表达与脑膜瘤病理分级呈正相关(ρ=0.627，P=0.007 5；ρ=0.691，P=0.007 1)，maspin蛋白表达与脑膜瘤病理分级呈负相关(ρ=-0.552，P=0.006 3)。

3 讨论

ATF3是ATF/CREB家族的成员之一，参与人体的多种生理功能，包括维持细胞稳态、损伤修复、细胞黏附、肿瘤细胞侵袭、细胞凋亡和信号转导途径等[8]。ATF3在正常细胞中低表达，但在多种体内外应激信号如化疗、缺氧、DNA损伤和细胞因子等诱导

注：与正常脑组织相比，#P<0.05图5 脑膜瘤组织和正常脑组织maspin mRNA的总体差异比较Figure 5 Comparison of the overall difference of maspin mRNA between meningioma tissue and normal brain tissue

注：与正常脑组织相比，◆P<0.05

下表达能快速上调，从而上调其靶基因转录水平，引起细胞内的一系列变化[9]。有本研究发现ATF3是一种致癌基因，加速细胞增殖，高表达于多种恶性肿瘤组织，与恶性肿瘤的侵袭、转移及预后紧密相关[10]。JANZ等[11]研究发现与非何杰金氏病淋巴瘤和非恶性组织对比，何杰金氏病患者中ATF3的高度表达。宋魏等[12]研究显示ATF3在乳腺浸润性导管癌中的阳性表达率显著高于癌旁乳腺组织，并与乳腺癌的组织学分级相关，结果表明与乳腺癌的侵袭及转移能力与ATF3的高水平认真表达关系密切。LI等[13]的实验表明肺癌的组织学分级、淋巴结转移及总生存率降低与ATF3的高水平认真表达存在显著相关性，提示ATF3表达上调可促进肺癌的迁移和侵袭。研究[14]显示在正常脑组织中ATF3呈低水平表达，而在Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤中，ATF3的表达逐级增强，且其表达与胶质瘤病理分级呈正相关，也提示ATF3高表达与胶质瘤的演进及恶性程度密切相关。这些研究表明ATF3表达促进了人癌细胞的增殖。本研究显示脑膜瘤中ATF3的mRNA和蛋白表达

显著高于正常脑组织，ATF3蛋白和mRNA表达与脑膜瘤病理分级呈正相关，提示脑膜瘤进展和侵袭机制与ATF3的高水平表达密切相关，可能成为评估患者预后的重要指标之一。

maspin是一种肿瘤抑制基因，通过抑制肿瘤细胞运动和诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤的侵袭和转移[15-16]。maspin蛋白高表达于多种正常人体组织，而在多种恶性肿瘤中如乳腺癌、肺癌、黑素瘤、口腔癌、胃癌和前列腺癌等中表达下调或不表达，常暗示预后不良[17-18]。研究[14]也显示了相似的结果，在正常脑组织中maspin蛋白和mRNA呈高水平表达，但在Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤中maspin呈低水平表达，随着病理级别表达逐级减弱，其表达与胶质瘤病理分级呈负相关。本研究同样发现maspin在正常脑组织和I脑膜瘤中的蛋白和mRNA呈高水平表达，在Ⅱ和Ⅲ级脑膜瘤中maspin表达水平较低，且与脑膜瘤病理分级呈负相关，提示maspin与脑膜瘤的进展、复发及不良预后有关。

目前许多研究已经证实MMP2是一种肿瘤促进基因，高表达于多种恶性肿瘤组织，如脑胶质瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌等，它促进肿瘤形成新生血管，加速肿瘤细胞的浸润和形成转移灶[19]。多项研究[20]表明人脑胶质瘤标本中MMP2呈高表达，MMP2表达水平与胶质肿瘤细胞侵袭力密切相关。多项研究[21-22]发现脑膜瘤组织中MMP2的蛋白含量显著高于正常脑膜组织，它与脑膜瘤组织内细胞的增殖、侵袭与复发显著相关。研究[14]也显示了相似的结果，在正常脑组织中MMP2呈低水平表达，而在Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤中MMP2的表达逐级增强，且其表达与胶质瘤病理分级呈正相关。本研究显示MMP2在脑膜瘤中的蛋白和mRNA表达明显高于正常脑组织，MMP2蛋白和mRNA表达与脑膜瘤病理分级呈正相关，说明促侵袭基因MMP2的高表达与脑膜瘤恶性进展和不良预后密切相关。

本试验表明ATF3、maspin和MMP2的表达与人脑脑膜瘤恶性分化程度密切相关，三个基因在各病理级别脑膜瘤之间比较差异有统计学意义，相关性研究发现，ATF3和MMP2在脑膜瘤中的表达呈正相关，ATF3和maspin在脑膜瘤中的表达呈负相关；在Ⅱ和Ⅲ级脑膜瘤中ATF3和MMP2表达较高，maspin表达较低；在Ⅰ级脑膜瘤中则相反，其具体的信号传导机制还有待进一步研究证实。