腺嘌呤致慢性肾功能衰竭大鼠模型制备及钙磷代谢变化

高艳 刁宗礼 张启东 刘文虎

至2030年，全球尿毒症患者人数预计将高达544万，其中亚洲地区增长速度最快，尤其是中国[1]。对此，除了努力提高人们对慢性肾脏病的早发现和早治疗意识，还须建立一个模拟慢性肾功能衰竭(CRF)早期阶段的实验模型，从而能够评估减缓或阻止疾病进展的治疗策略。CRF常伴随钙磷代谢紊乱，血管钙化是CRF患者心血管死亡的主要危险因素之一[2]。因此，选择恰当的动物模型进行钙磷代谢研究具有重要意义。由于文献中较少涉及CRF大鼠粪及尿液的钙磷排泄，本研究进行初步探讨，以期为建立CRF的模型及研究钙磷代谢提供实验依据及参考。

材料与方法

1.材料：健康无特定病原体的雄性SD大鼠(SPF级)80只，体质量(224.31±6.26) g，由北京大学医学部实验动物科学部供给。饲料由北京华阜康生物科技有限公司供给。腺嘌呤(Adenine)分子量135.13由美国Sigma公司供给。

2.方法:将雄性SD大鼠适应性饲养1周后,随机分为正常对照组(22只)和CRF组(58只)。CRF组大鼠给予0.75%腺嘌呤饲料喂食，自由饮水。正常对照组大鼠自由摄取普通饲料、饮水。实验周期为6 周。每天观察所有大鼠饮食、精神、反应、活动、毛发及尿量等情况。6 周后测量大鼠体质量,用代谢笼收集其24 h尿液及粪便,取眼眶静脉血约1 ml，以4 000 r/min离心10 min,分离血清检测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、钙、磷及尿钙和磷、粪钙水平。断头处死大鼠并迅速取部分肾脏组织,用10%福马林液固定,石蜡包埋后切片、染色，行光镜病理组织学检查并摄片。以肉眼和显微镜观察肾脏组织的大体及病理变化。本研究经首都医科大学附属北京友谊医院动物保护研究小组委员会(批准号16-1012)审核批准，并按照国家卫生研究院实验室动物保护和使用指南进行。

结 果

1.大鼠一般状态:正常对照组大鼠饮食如常,反应灵敏,体毛顺滑有光泽,二便正常。CRF组大鼠随着喂食腺嘌呤天数增加,与正常对照组比较逐渐出现摄食量减少，到第5周后饮水量和尿量明显增加,消瘦明显,体毛逐渐干枯萎黄脱落稀疏，松散无光泽，同时体重下降，并出现精神萎靡,活动力下降,行动无力，弓背、蜷缩等。

2.大鼠死亡情况:正常对照组大鼠饲养中未出现死亡，CRF组大鼠死亡20只，总死亡率高达34.48%。

3.两组大鼠血生化功能比较:CRF组大鼠血BUN、SCr水平均高于正常对照组，体重及血钙水平均低于正常对照组(P<0.05),而两组血磷水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组大鼠血生化功能比较

4.两组大鼠24 h尿磷和钙、粪钙代谢水平比较:与正常对照组比较，CRF组大鼠24 h尿量明显增多，波动在15～45 ml，平均尿量(30.45±8.60) ml，对照组大鼠尿量一般在8～10 ml，平均尿量(10.21±2.35) ml。CRF组大鼠24 h尿钙及尿磷代谢水平明显高于正常对照组，校正体质量后的24 h尿磷和钙、粪钙代谢水平仍均高于正常对照组(P<0.01)。见表2。

表2 两组大鼠24 h尿钙、磷及粪钙代谢水平比较

5.两组大鼠肾脏组织病理学检查结果:肉眼下可见正常对照组大鼠肾脏呈红褐色，表面圆润光滑，质软，皮髓质分界清楚。CRF组大鼠肾脏较正常对照组明显增大，呈灰白色，质地较硬，表面凹凸不平，可见弥漫的小米粒大小的白色颗粒，肾皮质变薄，皮髓质分界不清，呈“大白肾”，触之易碎，重量较对照组重3～6倍,见图1。光镜下可见正常对照组大鼠肾脏组织肾小球数量及结构无明显异常，未见纤维化等病变，肾小管排列整齐，上皮完好，未见变性、坏死及管型，肾间质未见炎症细胞浸润及纤维化；CRF组大鼠肾脏组织肾小球数量明显减少,残存肾小球结构紊乱，肾小管呈囊性扩张，肾小管内可见许多棕褐色针状结晶沉积，肾脏局灶间质纤维化，伴大量淋巴和单核细胞浸润，肾脏血管数量明显减少，肾小球囊腔扩大，远曲小管和集合管扩张,腔内有炎性细胞的浸润,成纤维细胞明显增多。见图2、3。

讨 论

理想的动物模型应具备良好的临床相似性,相似度越高,越有利于人类疾病的研究。目前使用的CRF模型很多，从造模机制上分为以下几种：(1)物理学方法，其中肾大部切除法以减少或破坏肾脏组织应用较多；(2)化学方法，利用肾毒性药物破坏肾脏组织，如腺嘌呤诱导CRF模型是肾病科研领域应用较多的经典方法之一[3]。腺嘌呤诱导造模型方法包括灌胃法和混入饲料喂养法。腺嘌呤剂量的大小和喂养时间的长短可诱发轻、中、重度不同肾功能衰竭模型。有关文献报道腺嘌呤150 mg·kg-1·d-1灌胃第4周时大鼠肾功能出现异常；第8周时出现与人类CRF相类似的贫血、高血压、脂代谢及钙磷代谢紊乱；第12周时肾功能严重受损,并发症突出；停止腺嘌呤灌胃并继续饲养,肾功能继续下降,提示肾脏病变已进入不可逆转的慢性进展过程，若以腺嘌呤300 mg·kg-1·d-1灌胃3周时大鼠死亡率高达42.86%[4]。以0.75%腺嘌呤300 mg·kg-1·d-1饲料连续喂养4周，大鼠血SCr、BUN水平明显升高，若此时停药，间隔1个月再采血，SCr及BUN水平明显下降,说明喂养腺嘌呤饲料4周对制造稳定的大鼠CRF模型是不够的[5]。本研究预实验也发现腺嘌呤饲养4周后投喂大鼠正常饲料，间隔2周其体重增加，毛发光泽度增加，活动度好，SCr及BUN上升，故本实验CRF造模周期设为6周。随着喂食腺嘌呤时间的增加，大鼠日渐消瘦,畏寒肢冷、蜷缩弓背、精神萎靡、体毛脱落、活动减少，尿量明显增多,BUN、SCr水平升高。第5周时大鼠开始逐渐出现死亡，最终死亡率高达34.48%,分析原因可能为造模药物相关死亡。造模6周时检测大鼠SCr基本波动在200～350 μmol/L，这些均提示腺嘌呤造模成功。

CRF大鼠模型肾脏体积增大，重量增加，呈“大白肾”，符合既往学者报道该模型肾脏体积变化与实际临床CRF肾体积缩小存在差异。光镜下肾脏组织中大量的黄褐色二羟基腺嘌呤结晶沉积,部分肾小管完全破坏并有炎性细胞浸润,局部纤维组织增生。说明利用0.75%腺嘌呤饲养大鼠,可成功制备CRF模型。有关研究报道口服腺嘌呤通过黄嘌呤氧化酶的作用被迅速代谢成极难溶于水的2，8-二羟基腺嘌呤，沉积在近端管状上皮根尖区形成晶体，影响氮质化合物的排泄，从而影响组织内细胞的损伤，导致血BUN和SCr水平升高，最终导致肾功能不全[6-7]。也有文献报道电镜下可见肾小管上皮细胞内有结晶沉积和大量胶原纤维,提示肾小管上皮细胞可吸收结晶，并可能发生肾小管上皮细胞转分化，参与肾间质纤维化的进展[8]，其机制是利用肾毒性药物导致肾脏损害的原理，同时这种诱导CRF的方法避免了手术(如肾脏切除术和电灼术)诱导CRF的潜在并发症，为研究CRF的较好模型。腺嘌呤混合饲料喂养，操作简便，节省了人力和花费，肾脏衰竭现象明显，有重要的科研价值。

钙稳态对于确保生理内环境的稳定至关重要，因此，血钙水平必须在很窄的范围内波动以精确调节游离细胞外钙的水平[9]。血管钙化是CRF患者心血管死亡和全因死亡的主要危险因素，发病机制尚不清楚[2]。本研究中CRF组大鼠给予0.75%腺嘌呤饲养6周后出现钙磷代谢紊乱，血钙较正常对照组下降，血磷较正常对照组增高。分析其原因为腺嘌呤对肾小管破坏，肾脏局灶间质纤维化，使得肾小管对钙磷重吸收功能下降，表现为多尿、尿钙增加及血钙下降。慢性肾脏病是一种功能性维生素D缺乏的状态，后者缺乏导致胃肠道钙吸收减少[10]，进一步导致粪钙增加,血钙降低。患有相对较严重疾病的儿童，包括幼年类风湿性关节炎、幼年皮肌炎和严重厌食神经症[11]，钙吸收能力均低于年龄、性别和青春期状况相匹配的健康儿童组。有关文献报道正常钙摄入时，慢性肾脏病患者胃肠道钙吸收能力低于正常对照组，进入血液透析阶段的患者钙吸收能力较正常人群低[12],进一步支持了推论。

CRF组与正常对照组大鼠24 h粪钙无明显差异。因CRF组大鼠体重明显低于对照组，故进行体重校正后比较发现，CRF组大鼠造模后24 h粪钙水平较正常对照组明显升高。同时通过体重校正，可以比较不同物种、同物种不同年龄阶段(如老人、儿童)钙的排泄，从而对钙的流失及补充起一定指导意义。多种因素可能影响钙的摄入量和吸收率，从而影响粪钙水平。幼犬低磷饮食后血磷下降，血清钙浓度呈相反的变化趋势[13]，提示磷的变化会影响体内钙代谢变化。小肠对钙吸收的同时通过上皮细胞的脱落和消化腺分泌将体内的钙从肠道排到体外，这些被肠道排出的钙即为内源性粪钙(EFC)，狗的EFC水平为15～20 mg/kg，为成人(1.5～2.0 mg/kg)的10倍。有关报告早产儿的EFC更高(17～86 mg·kg-1·d-1)。狗的EFC与尿钙比为20 ∶1，而在人类中通常约为1∶1[14]。在体内钙丢失上，EFC无论从数量还是重要性上都比尿钙重要，EFC的探讨也许对于体内钙的代谢及钙化的深入研究有一定参考价值。CRF组大鼠SCr较正常对照组明显增加，且出现钙磷代谢紊乱，肾脏病理变化也较明显。本实验的不足之处在于虽然实验中已留取24 h尿量，但未检测尿肌酐及进一步计算内生肌酐清除率(Ccr)以反映肾脏病变严重程度，因此无法类比人类的肾功能分期。

对于透析前血钙水平正常的患者,若使用钙离子浓度超过1.5 mmol/L的透析液,则有20.0%～83.3%的患者会发生高钙血症,从而加重了转移性钙化的发生[15]。若钙负荷增加,对于少尿或无尿的透析患者，除了血管软组织钙质沉积外，EFC是否排泄增加，磷摄入量、钙摄入量和吸收分数之间的相互作用对EFC的影响程度值得进一步探讨。