circNT5E通过调控miR-506-3p表达对结肠癌细胞迁移、侵袭和凋亡的影响

孟凡迪 徐勤鸿 杨刚华 万永 张雷

结肠癌是一种临床常见的消化道恶性肿瘤，在各类恶性肿瘤中发病率较高，预后差，新的靶向治疗药物的应用为晚期结肠癌的治疗开辟了新的前景［1-2］。研究结肠癌转移、凋亡的分子机制有利于寻找新的靶向药物治疗靶点。环状RNA（Circular RNA，circRNA）是一种新的内源性非编码RNA，其异常表达与肿瘤的发生、发展相关［3］。寻找在结直肠癌中存在差异表达并具有重要生物学功能的circRNA，将为阐明结肠癌的发病机制奠定基础，且可为结直肠癌的诊治提供新的靶点及思路［4］。circNT5E 是来自NT5E 的circRNA，有研究报道circNT5E 在胶质瘤组织中高表达，敲低其表达可通过调控miR-422a 抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡［5］。circNT5E 在非小细胞肺癌组织和细胞中上调表达，沉默其表达通过海绵化miR-134 抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移，并诱导凋亡［6］。然而circNT5E 对结肠癌细胞迁移、侵袭和凋亡的影响及其机制还尚未清楚。研究报道miR-506 可抑制结肠癌增殖［7］。miR-506-3p 过表达抑制前列腺癌肿瘤的进展，可作为前列腺癌中的新型肿瘤抑制物［8］。上调miR-506-3p 表达可抑制卵巢癌细胞生长和增殖［9］。因此，本实验旨在研究circNT5E 对结肠癌细胞迁移、侵袭和凋亡的影响及其机制是否与miR-506-3p 表达有关。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2017年1月至2019年5月本院经病理检测为结肠癌且具有完整临床病理资料的患者组织标本40 例，其中 男22 例，女18 例，年龄16～68岁。以患者癌组织边缘2～5 cm 处切除的癌旁组织作为对照，所有患者术前均未接受放化疗，无其他合并肿瘤。所有患者均知情且同意。

1.2 细胞与主要试剂

结肠癌细胞HCT116 购自上海彩佑实业有限公司；胎牛血清、RPMI-1640 培养基购自上海研谨生物科技有限公司；荧光定量PCR 试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；Transwell 小室、Matrigel 胶购自美国Bio-Rad 公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭（Annexin V-FITC/PI）凋亡检测试剂盒购自北京凯瑞基生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒购自上海圻明生物科技有限公司；MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、GAPDH 抗体及HRP 标记的山羊抗兔IgG 购自上海恒斐生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京博迈斯科技发展有限公司。

1.3 细胞培养与分组

将结肠癌细胞HCT116 接种在RPMI-1640 培养液（含10%胎牛血清）中，在37℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞，将si-NC、si-circNT5E、pcDNA、pcDNA-circNT5E、miR-NC、miR-506-3p 分别转染至HCT116 细胞中，命名为si-NC 组、si-circNT5E 组、pcDNA 组、pcDNA-circNT5E 组、miR-NC 组、miR-506-3p 组；将si-circNT5E 分别与anti-miR-NC、anti-miR-506-3p 共转染至HCT116细胞中，命名为si-circNT5E+anti-miR-NC 组、si-circNT5E+anti-miR-506-3p 组。

1.4 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测circNT5E和miR-506-3p 的表达水平

详细步骤参照文献［7］，其中PCR 循环条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s；72℃延伸30 s，共40 个循环；60℃延长5 min。

1.5 显色原位杂交（CISH）检测癌组织中circNT5E 表达

将10%福尔马林固定、石蜡包埋的结肠癌组织和癌旁组织标本切片，厚4 μm，将切片50℃烤片过夜，脱蜡、水化、抗原修复，100℃烤箱孵育15 min，蛋白酶K 消化、脱水。杂交过夜，DAB 显色，苏木素复染，中性树胶封片、显微镜下观察拍照。

1.6 Transwell 检测细胞迁移和侵袭

将基质胶（Matrigel）与RPMI -1640 培养液以1∶5 比例混匀，然后取100 μL 加入Transwell 小室的上室，凝固后取100 μL 细胞悬液接种于上室，培养24 h。然后分别用4%多聚甲醛固定和0.1%结晶紫染色，显微镜下随机观察5 个视野，计算细胞迁移数目和侵袭数目。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

取培养24 h 后的各组细胞，PBS 漂洗胞2 次，然后分别加入10 μL 的Annexin V-FITC 和5 μL 的PI，轻摇混匀，常温避光孵育15 min，流式细胞仪检测。每组设3 个复孔，实验重复3 次。

1.8 蛋白质印迹（Western blot）法检测MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax 蛋白表达

详细步骤参照文献［7］，其中一抗工作液以1∶800 稀释，二抗工作液以1∶1 000 稀释。每个蛋白样品设3 个重复。

1.9 双荧光素酶报告实验验证circNT5E 和miR-506-3p 的靶向关系

构建包含miR-506-3p 结合位点的circNT5E 野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-circNT5E、MUT-circNT5E，将其分别与miR-NC、miR-506-3p共转染至结肠癌细胞中，转染48 h 后，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.10 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件进行数据分析，计量资料用（）表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circNT5E 和miR-506-3p 在结肠癌组织中的表达

与癌旁组织相比，结肠癌组织中circNT5E 呈阳性表达，且表达水平显著升高，miR-506-3p 表达水平显著降低（P＜0.05）。见图1，表1。

表1 circNT5E和miR-506-3p在结肠癌组织中的表达（±s）Table 1 Expressions of circNT5E and miR-506-3p in colon cancer tissues（±s）

表1 circNT5E和miR-506-3p在结肠癌组织中的表达（±s）Table 1 Expressions of circNT5E and miR-506-3p in colon cancer tissues（±s）

分组癌旁组织结肠癌组织t 值P 值n 40 40 circNT5E 1.00±0.08 3.37±0.31 46.818 0.000 miR-506-3p 1.00±0.05 0.48±0.04 51.362 0.000

2.2 沉默circNT5E 表达对结肠癌HCT116 细胞迁移、侵袭和凋亡的影响

与si-NC 组相比，si-circNT5E 组结肠癌HCT116 细胞中circNT5E 表达水平显著降低，迁移、侵袭细胞数显著降低，细胞凋亡率显著升高，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表达水平显著降低，Bax 表达水平显著升高（P＜0.05）。见表2。

2.3 miR-506-3p 过表达对结肠癌HCT116 细胞迁移、侵袭和凋亡的影响

与miR-NC 组相比，miR-506-3p 组miR-506-3p表达水平显著升高，迁移、侵袭细胞数显著降低，细胞凋亡率显著升高，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表达水平显著降低，Bax 表达水平显著升高（P＜0.05）。见表3。

2.4 circNT5E 靶向调控miR-506-3p 的表达

StarBase 在线软件预测显示circNT5E 的序列中含有与miR-506-3p 互补的核苷酸序列见图2，双荧光素酶报告实验结果显示，与miR-NC组相比，miR-506-3p 组转染WT-circNT5E 载体的细胞荧光素酶活性显著降低（P＜0.05），转染MUT-circNT5E 载体的细胞荧光素酶活性无显著变化差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。与pcDNA 组相 比，pcDNA-circNT5E 组miR-506-3p 表达水平显著降低（P＜0.05）；与si-NC 组相比，si-circNT5E 组miR-506-3p 表达水平显著升高（P＜0.05）。见表5。

表2 沉默circNT5E 表达对结肠癌HCT116 细胞迁移、侵袭和凋亡的影响（±s）Table 2 Effect of silenced circNT5E expression on migration，invasion and apoptosis of colon ca cellsncer HCT116（±s）

表2 沉默circNT5E 表达对结肠癌HCT116 细胞迁移、侵袭和凋亡的影响（±s）Table 2 Effect of silenced circNT5E expression on migration，invasion and apoptosis of colon ca cellsncer HCT116（±s）

分组si-NC 组si-circNT5E 组t 值P 值circNT5E 1.00±0.06 0.53±0.05 18.053 0.000迁移细胞数（个）98.32±9.54 43.25±4.87 15.424 0.000侵袭细胞数（个）79.63±7.25 34.11±3.69 16.787 0.000凋亡率（%）6.25±0.52 23.14±2.33 21.225 0.000 MMP-2蛋白0.71±0.07 0.31±0.03 15.757 0.000 MMP-9蛋白0.63±0.06 0.26±0.02 17.551 0.000 Bcl-2蛋白0.58±0.05 0.20±0.02 21.169 0.000 Bax 蛋白0.33±0.03 0.78±0.07 17.726 0.000

表3 miR-506-3p 过表达对结肠癌HCT116 细胞迁移、侵袭和凋亡的影响（±s）Table 3 Effects of miR-506-3p overexpression on migration，invasion and apoptosis of colon cancer HCT116 cells（±s）

表3 miR-506-3p 过表达对结肠癌HCT116 细胞迁移、侵袭和凋亡的影响（±s）Table 3 Effects of miR-506-3p overexpression on migration，invasion and apoptosis of colon cancer HCT116 cells（±s）

分组miR-NC 组miR-506-3p 组t 值P 值miR-506-3p 1.00±0.08 2.84±0.27 19.602 0.000迁移细胞数（个）94.36±9.44 55.21±5.52 10.740 0.000侵袭细胞数（个）76.32±7.61 40.25±4.58 12.183 0.000凋亡率（%）7.36±0.78 18.63±1.25 22.947 0.000 MMP-2蛋白0.70±0.07 0.36±0.03 13.393 0.000 MMP-9蛋白0.65±0.06 0.29±0.03 16.100 0.000 Bcl-2蛋白0.56±0.05 0.25±0.02 17.270 0.000 Bax蛋白0.32±0.03 0.74±0.07 16.545 0.000

表4 双荧光素酶报告实验（±s）Table 4 Double luciferase report experiments（±s）

表4 双荧光素酶报告实验（±s）Table 4 Double luciferase report experiments（±s）

分组miR-NC 组miR-506-3p 组t 值P 值WT-circNT5E 1.03±0.06 0.61±0.06 14.849 0.000 MUT-circNT5E 1.05±0.09 1.01±0.08 0.997 0.334

表5 circNT5E 调控miR-506-3p 的表达（±s）Table 5 circNT5E regulates miR-506-3p expression（±s）

表5 circNT5E 调控miR-506-3p 的表达（±s）Table 5 circNT5E regulates miR-506-3p expression（±s）

注：与pcDNA 组比较，aP＜0.05；与si-NC 组比较，bP＜0.05。

分组pcDNA 组pcDNA-circNT5E 组si-NC 组si-circNT5E 组F 值P 值miR-506-3p 1.00±0.08 0.57±0.05a 1.01±0.06 2.63±0.25b 396.140 0.000

2.5 抑制miR-506-3p 表达逆转了沉默circNT5E 表达对结肠癌HCT116 细胞迁移、侵袭和凋亡的作用

与si-circNT5E+anti-miR-NC 组相比，sicircNT5E+anti-miR-506-3p 组miR-506-3p 表达水平显著降低，迁移、侵袭细胞数显著升高，细胞凋亡率显著降低，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表达水平显著升高，Bax 表达水平显著降低（P＜0.05）。见表6。

3 讨论

circRNA 具有高丰度性、稳定性、保守性的特点，在多种恶性肿瘤的发生发展起重要作用，有望成为新的诊断、预测肿瘤的生物标志物及精准治疗的靶点［10］。研究报道circCCDC66 可促进结肠癌的生长和转移［11］。circPIP5K1A 可抑制结肠癌细胞活力及侵袭、迁移［12］。说明circRNA 参与结肠癌的发生发展过程。本实验结果显示，结肠癌患者组织中circNT5E 表达水平显著升高，说明circNT5E 与结肠癌有关。且沉默circNT5E 后，迁移、侵袭细胞数显著降低，细胞凋亡率显著升高，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表达水平显著降低，Bax 表达水平显著升高。说明沉默circNT5E 可抑制结肠癌细胞迁移、侵袭，促进细胞凋亡。

研究表明异常表达的miRNA 也参与结肠癌的进展，与其预后相关，可作为预后检测标志物［13］。miR-506-3p 在骨肉瘤组织和细胞中表达下调，上调其表达抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭［14］。本实验结果显示，结肠癌组织中miR-506-3p 表达水平显著降低。过表达miR-506-3p，迁移、侵袭细胞数显著降低，细胞凋亡率显著升高，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表达水平显著降低，Bax 表达水平显著升高。说明过表达miR-506-3p 可抑制结肠癌细胞迁移、侵袭，促进细胞凋亡。有研究报道，敲除lncRNA NEAT1 可通过上调miR-506-3p 诱导胰腺癌细胞的细胞周期停滞和促进细胞凋亡而显著抑制细胞增殖［15］。lncRNA SNHG17 通过靶向miR-506-3p/CTNNB1 轴激活Wnt/β-catenin 信号通路促进神经胶质瘤的发展［16］。研究表明circRNA 可充当miRNA 的“海绵”，从而参与基因的表达调控。本实验结果显示，circNT5E 靶向调控miR-506-3p，抑制miR-506-3p 表达逆转了沉默circNT5E 表达对结肠癌HCT116 细胞迁移、侵袭和凋亡的作用。

表6 抑制miR-506-3p 表达逆转了沉默circNT5E 表达对结肠癌HCT116 细胞迁移、侵袭和凋亡的作用（±s）Table 6 Inhibition of miR-506-3p expression reverses the effects of silenced circNT5E expression on colon cancer HCT116 cell migration，invasion and apoptosis（±s）

表6 抑制miR-506-3p 表达逆转了沉默circNT5E 表达对结肠癌HCT116 细胞迁移、侵袭和凋亡的作用（±s）Table 6 Inhibition of miR-506-3p expression reverses the effects of silenced circNT5E expression on colon cancer HCT116 cell migration，invasion and apoptosis（±s）

注：与si-NC 组比较，a P＜0.05；与si-circNT5E+anti-miR-NC 组比较，bP＜0.05。

分组si-NC si-circNT5E si-circNT5E+anti-miR-NC si-circNT5E+anti-miR-506-3p F 值P 值miR-506-3p 1.00±0.05 2.69±0.26a 2.71±0.27 1.55±0.15b 158.217 0.000迁移细胞数（个）97.25±9.36 45.28±4.29a 44.65±4.33 81.21±8.36b 128.736 0.000侵袭细胞数（个）77.63±7.58 38.33±3.68a 36.94±3.57 60.36±6.07b 112.801 0.000凋亡率（%）7.03±0.71 22.36±2.24a 24.69±2.41 12.65±1.27b 190.797 0.000 MMP-2蛋白0.72±0.07 0.32±0.03a 0.30±0.03 0.60±0.06b 151.340 0.000 MMP-9蛋白0.66±0.06 0.28±0.03a 0.26±0.03 0.57±0.05b 187.253 0.000 Bcl-2蛋白0.57±0.05 0.23±0.02a 0.21±0.02 0.46±0.04b 228.429 0.000 Bax蛋白0.31±0.03 0.77±0.07a 0.79±0.08 0.43±0.04#152.609 0.000

综上所述，沉默circNT5E 表达可能通过上调miR-506-3p 的表达抑制结肠癌HCT116 细胞迁移、侵袭，促进细胞凋亡。