液相芯片技术检测地中海贫血国家参考品

张文新 林卫萍 孙楠 高飞 孙晶 黄杰★ 曲守方★

遗传性血红蛋白疾患，包括地中海贫血和镰状细胞疾病，是全球最常见的单基因病之一。地中海贫血是一种人类单基因疾病，根据致病机制的不同，分为α-地中海贫血以及β-地中海贫血［1-2］。α-地中海贫血由位于16 号染色体上的α珠蛋白基因发生缺失、插入、突变、重排等因素导致，β-地中海贫血由位于11 号染色体上的β 珠蛋白基因缺失、插入、突变、重排等因素导致，基因变异导致α 与β 珠蛋白基因的不平衡表达，是形成地中海贫血的主要病因［3-6］。

产前基因筛查是目前预防地中海贫血的主要手段。地中海贫血（α/β 型）基因检测试剂盒的原理是基于液相悬浮阵列技术（suspension array），即国内常称的液相芯片。它的核心技术就是采用被编码的微球取代了常规基因芯片的固相载体，每个检测用的具有生物识别功能的分子对应一种编码的微球，可以在一个体系实现多种基因突变位点检测。它具有生物芯片的高通量、高集成、微型化、连续化和自动化等优点，还具有液相反应的高敏感性、高重复性、检测线性范围宽、反应快速等优点，并且该方法操作简便、快捷、样品用量少。其检测原理示意图。见图1、图2。

本研究使用液相芯片技术对来自中国食品药品检定研究院提供的地中海贫血核酸检测国家参考品进行检测，用于评价该技术方法试剂盒的质量。

1 材料与方法

1.1 研究对象

中国食品药品检定研究院提供的32 例地中海贫血核酸检测国家参考品的DNA。

1.2 仪器与试剂

Applied Biosystems Veriti Dx 热循环仪购自美国赛默飞世尔科技公司；Luminex Magpix 仪器购自美国Luminex 公司；地中海贫血（α/β 型）基因检测试剂盒（PCR-流式荧光杂交法）由中山大学达安基因股份有限公司提供；地中海贫血核酸检测国家参考品由中国食品药品检定研究院提供。

1.3 方法

1.3.1 样本处理

将样本稀释至12.5 ng/μL，严格按地中海贫血（α/β 型）基因检测试剂盒（PCR-流式荧光杂交法）说明书进行PCR 扩增、杂交、显色等步骤。

1.3.2 检测

具体操作为：①运行xponet4.2 软件，打开Plate Heater，使之加热到55℃。②打开Samples 选项，点击Create New Samples 输入样品信息。③将孵育后的反应物转移到Magpix 设备上，并点击“run”读取Net MFI。

1.3.3 结果判读

根据试剂盒说明书对检测结果进行判读。

2 结果

2.1 野生型位点信号值以及N/M 值分布情况（非缺失型）

野生型位点信号值以及N/M 值分布情况（非缺失型）。见表1。所有野生型位点检测结果均与国家参考品结果一致。

2.2 阳性位点信号值以及N/M 值分布情况（非缺失型）

阳性位点信号值以及N/M 值分布情况（非缺失型）结果见表2。各位点杂合位点比值在0.76～1.77 之间，纯合型位点比值在0.06～0.07 之间；各位点N/M 比值均落在相应的杂合或纯合区间。经统计，所有阳性位点检测结果均与国家参考品结果一致。

2.3 缺失型信号值分布情况

缺失型样本信号值分布情况见表3。所有缺失样本检测结果均与国家参考品型别一致。

2.4 不同型别样本与微球信号值关系（非缺失型）

以IVS-II-654 位点为代表，不同型别检测结果见图3。

编码为52 号的微球偶联了IVS-II-654 位点野生型探针（N 探针），编码为62 号的微球偶联了IVS-II-654 位点突变型探针（M 探针）。对于IVS-II-654 位点野生型样本，52 号微球产生信号值远大于62 号微球；对于IVS-II-654 位点杂合型样本，52号微球产生信号值与62 号微球信号值差异不大；对于IVS-II-654 位点纯合型样本，52 号微球产生信号值远远小于62 号微球。

表1 样本野生型位点检测结果（非缺失型）Table 1 Results of wild type loci in samples（non-deletion genetype）

表2 样本阳性位点检测结果（非缺失型）Table 2 Results of mutant type loci in samples（non-deletion genetype）

表3 样本检测结果（缺失型）Table 3 Results of samples（deletion genetype）

2.5 不同型别样本与微球信号值关系（缺失型）

以4.2 缺失位点为代表，不同型别检测结果见图4。

编码为57 号的微球偶联了4.2 缺失型探针（4.2 探针），编码为72 号的微球偶联了缺失野生型探针（α2 探针）。对于缺失野生型样本，72 号微球产生信号值远大于57 号微球；对于4.2 缺失杂合型样本，57 号微球产生信号值与72 号微球信号值差异不大；对于4.2 缺失纯合型样本，57 号微球产生信号值远远大于72 号微球。

3 讨论

地中海贫血主要是由珠蛋白基因异常引起的。世界上约有4.83%的人口携带珠蛋白变异基因，我国发病率较高的广西、广东人群中地中海贫血基因携带率为12.22%～23.02%。目前该病尚无有效的治疗方法，因此遗传咨询、产前诊断以及在我国南方开展大人群的分子筛查作为防治该疾病的首要途径，对控制重型地贫患儿的出生，提高出生人口素质具有重要意义［7-10］。

基因检测在地中海贫血的预防中发挥了极其重要的作用。目前临床基因检测手段主要有反向点杂交法、跨越断裂点PCR 法（Gap-PCR）等。反向点杂交法可用时对未知样本中多个突变进行筛查大大提高了诊断效率。但缺点是操作繁琐。跨越断裂点PCR 法，主要用于α 地贫的基因诊断，其缺陷就是只能诊断缺失大片段缺失型样品而不能诊断点突变，且容易产生假阳性结果。

本研究基于液相芯片的技术特点，将20 个点突变位点的野生型探针以及突变型探针分别偶联到40 个具有特殊编码的微球中；将4 种缺失探针（3.7，4.2，SEA，α2）偶联到4 种具有特殊编码的微球中，同时设置一个微球用于质控。在含45 种微球的杂交体系中，利用液相芯片技术，设备将每种微球的信号一一计算，并转化为数字信号，经过运算快速实现了分型目的。

根据对地中海贫血核酸检测国家参考品中32例样本进行检测，结果表明：对于非缺失型，不同型别位点的N/M 值有显著差异。以CD41-42 位点为例，共计检测到30 例该位点野生型的样本、1 例该位点杂合型样本、1 例该位点纯合型样本。其中30 例野生型标本的N/M 值均大于或等于7.8，1 例杂合型标本的N/M 值为1.32，1 例纯合型样本比值为0.06。结果表明，利用液相芯片平台，可以显著区分三种型别的样本，并且利用N/M 值这种判读方式，可以显著修正因样本加样量增加、样本浓度波动等导致的背景信号、非特异信号升高等对结果的干扰，使检测结果准确率大大提高。对于缺失型，使用α2 探针作为内控，α2 与其余三种探针相互校验，可区分杂合缺失、纯合缺失、双重缺失以及缺失野生型。

本研究对地中海贫血核酸检测国家参考品中32 例样本进行检测，国家参考品的型别包括7 种α-地中海贫血基因突变类型以及18 种β-地中海贫血基因突变类型。在这32 例国家参考品中，3 例样本已知为野生型，6 例样本已知为试剂盒检测范围外位点阳性，23 例为试剂盒检测范围内位点阳性。经检测，试剂盒的结果符合国家参考品的预期结果，试剂盒检测范围内的国家阳性参考品均为相应基因型别，试剂盒检测范围内的国家阴性参考品均为野生型，准确性达100%。针对6 例试剂盒检测范围外位点阳性的国家参考品，因本试剂盒并未设计这些位点的相应探针，故无检测数据输出，对这些位点是否突变阳性并不进行判读；但对于试剂盒检测范围内的位点，其检测结果均为野生型，符合国家参考品的预期结果。

本研究局限性在于无法检测一些罕见地贫大片段缺失，如泰国型（--THAI），中国型（Gγ+（Aγδβ）0），东南亚型（SEA-HPFH），以及一些罕见碱基转换，如Codon37（TGG＞TAG），-90（C＞T）。针对目前罕见的大片段缺失，采用的方法通常为Gap-PCR 法，操作繁琐，且较容易污染［11-13］。进一步开发基于液相芯片法的试剂覆盖上述检测位点有利于推动地中海贫血产前筛查的普及率。

基于液相芯片技术的的地中海贫血（α/β 型）基因检测试剂盒，能够满足我国地中海贫血核酸检测国家参考品的要求，具有很好的质量，为地中海贫血基因检测提供了一种可靠的检测方法。