非小细胞肺癌患者ALK、ROS1及BRAF-V600E基因突变与临床特征的相关性

李华芳

肺癌是世界范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，同时还是男性癌症死因中的首位［1］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占所有肺癌的85%，大约有三分之二的NSCLC患者在确诊时已无根治性手术的机会［2］。由于他们的治疗方案有限，预后差，生存率低［3］。近年来，以分子靶向治疗为核心的个体化治疗逐渐成为NSCLC 治疗的研究热点。以EGFR-TKI 为代表的小分子酪氨酸蛋白激酶（PTK）抑制剂的应用，极大程度改善了NSCLC 患者的预后。在美国国家综合癌症网络（NCCN）“非小细胞肺癌精准治疗（2019V1）”中，非小细胞肺癌指南专家组强烈建议进行广泛的分子检测，其目的在于识别罕见的驱动突变；因此，本文探讨NSCLC 中间变性淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphomakinase，ALK）和原癌基因蛋白酪氨酸激酶（ROS proto-oncogene 1 receptor tyrosine kinase，ROS1）基因融合及鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体B1（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF）V600E 基因突变情况，分析其与临床病理特征（性别、年龄、吸烟史、组织学分型）的相关性，为促进NSCLC 靶向治疗的进展，改善患者的预后提供一定的数据支持。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集本院2015年9月1日至2019年9月1日期间NSCLC 的病例。排除经免疫组化标记仍未能明确组织学类型的或活检标本中肿瘤细胞数量较少、难以保证结果准确性的病例后，最终有1 042 例患者的石蜡包埋组织纳入研究。其中男性550 例，女性492 例；年龄≥60 岁560 例，年龄＜60 岁482 例；其中贴壁为主型腺癌492 例，实性腺癌为主型252 例，腺泡型腺癌为主型200 例，粘液性腺癌47 例，腺泡型伴微乳头型腺癌51 例。所有病理组织标本均应用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，蜡块资料保存完整。所有病例均进行了ALK及ROS1融合基因的检测，其中选取2018年以后的114 例进行了BRAF-V600E 的检测。

1.2 方法

采用人类ALK基因融合（生产批号11219041601X 11219032101X 11220010201X）和人类ROS1基因融合联合检测试剂盒（生产批号11219073102X 11219061202X），人 类BRAF基因V600E 突变检测试剂盒（生产批号11219090401Z 11219090201Z），均购自厦门艾德生物医药科技技术有限公司。取10 片5 μm 厚度的蜡卷脱蜡后加入蛋白酶K 液及Buffer RTL 进行组织裂解，按核酸提取试剂说明书操作方法及步骤进行RNA 及DNA 的提取。并通过ARMS-PCR 方法进行ALK、ROS1和BRAF-V600E 基因的检测，每一批次实验均设阴、阳性对照，所用仪器为美国IBM7500 实时荧光定量PCR，具体操作程序参考说明书，数据使用其配套版软件进行分析。

1.3 统计学分析

运用计算机软件SPSS 22.0 进行统计分析，计数资料用n（%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALK 基因检测结果及其与临床病理特征的关系

ALK 基因融合检测结果显示年龄≥60 岁的患者ALK基因融合阳性率低于年龄＜60 岁患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；而年龄＜51 岁NSCLC患者的ALK重排的概率低于年龄＜41 岁患者中ALK 重排概率；男女性在性别及是否吸烟及组织学亚型之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 ROS1基因检测结果及其与临床病理特征的关系

ROS1基因融合突变在性别及年龄上的比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；而与是否吸烟无相关性，差异无统计学意义（P＞0.05）。在组织学分型中更常见于腺泡型腺癌和微乳头状腺癌。见表2。

2.3 BRAF-V600E 基因检测结果及其与临床病理特征的关系

BRAF-V600E 检测结果显示年龄≥60 岁患者的BRAF-V600E 突变阳性率低于年龄＜60 岁阳性率，BRAF-V600E 基因突变与性别、年龄及有无吸烟史无相关性，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

3 讨论

据国家癌症中心2019年公布的全国癌症统计数据显示，肺癌的发病率和死亡率仍然居所有恶性肿瘤之首［4］。近年来，随着分子医学的进展和靶向药物的不断研发，肿瘤的治疗已进入到“个体化”医疗时代。NSCLC 研究热点更偏向对肿瘤携带的复杂基因突变进行系统的分子分型。准确检测EGFR、ALK、ROS1、BRAF等肺癌驱动基因的存在状态，可为NSCLC 患者的靶向用药治疗提供必要依据。

表1 ALK 基因突变与临床特征的相关性［n（%）］Table 1 Correlation between mutations of ALK gene and clinical features［n（%）］

表2 ROS1 基因突变与临床特征的相关性［n（%）］Table 2 Correlation between mutations of ROS1 gene and clinical features［n（%）］

表3 BRAF-V600E 基因突变与临床特征的相关性Table 3 Correlation between mutations of BRAF-V600E and clinical features

ALK基因定位于染色体2p23 带，其编码的ALK是胰岛素受体家族中成员，正常表达于神经系统。在NSCLC 患者中ALK基因断裂后主要和活化的EML4gene 融合，通过PIK3/AKT、MAPK/JAK/STAT3 等多条信号传导通路参与抑制细胞凋亡，促进细胞增殖。

国内杨衿记［5］等综合了全球17 个实验结果得出，在未经选择的NSCLC 患者中，EML4-ALK基因融合的发生率为0.4%～11.7%。东方人的阳性率为4.1%。在年轻NSCLC 患者中，发生ALK基因融合的概率高，在年龄＜51 岁的患者中，发生ALK融合的概率高达18.5%［6］。研究结果与上述报道一致［7］。有文献报道ALK基因融合情况多见于男性肺腺癌患者。在不吸烟或少吸烟的相对年轻的患者中阳性检出率较高［8］。而也有报道吸烟不是ALK融合基因的显著影响因素［7］。据文献报道ALK基因融合患者病理组织学类型常见于腺泡型腺癌、实性腺癌、粘液癌及印戒细胞癌，常见于年轻的肺腺癌患者，发现时常为晚期［9］。

有研究表明ALK可能是NSCLC 患者的独立预后因素［10］。临床试验显示克唑替尼对于ALK阳性的晚期NSCLC 患者，疗效优于传统化疗，二线单药治疗患者有效率达到65.3%，中位无进展生存期（PFS）为7.7 个月［9］。回顾性研究显示，克唑替尼后续治疗患者中位PFS 达17.4 个月，中位总生存期达49.4 个月［9］。本组有随访资料的ALK患阳性患者15 人接受克唑替尼治疗后，13 人相关症状明显得到改善，如咳嗽、呼吸困难减轻，胸水逐渐减少，转移灶消失，原发肿瘤病灶明显缩小；整体生活质量得到改善。但由于随访病例少且随访时间短，尚需继续跟踪随访以获取更多的数据。

ROS1基因重排代表一类新的独特的NSCLC分子亚型［11］，有文献报道ROS1融合基因在NSCLC 中的阳性率为1.0%～3.4%［12］，ROS1基因重排与ALK基因融合的NSCLC 患者在临床特征上有明显吻合，而且亚洲患者占多数。CAI W等［13］等发现在中国人群中ROS1重排阴性的患者相比阳性患者有一个相对好的预后。但是属于小样本范围内的比较，且未能在两组患者间发现吸烟史、性别及年龄上的差异。有研究认为，阳性多见于年轻、不吸烟、组织学低分化的肺腺癌患者［14］，组织成分中腺泡状和/或乳头状成分显著。

BRAF是一种编码丝氨酸/苏氨酸特异性激酶，属于RAF家族。RAF是RAS-RAF-MEK-ERK 信号转导通路中的重要成员，它与ERFR、ALK等均属于PTK家族，在肿瘤细胞增殖、分化和凋亡等方面发挥重要作用［15］。BRAF最常见的突变位点为BRAF-V600E，其突变将导致转导通路改变和激酶活性增加，进而导致肿瘤的产生及转移［16］。Karbel HAE［17］在9.3%的NSCLC 患者中发现了BRAFV600E 突变，Willenbacher E［18］等的研究显示，BRAF-V600E 突变更常见于吸烟者。既往研究表明BRAF-V600E 突变预后差［19］。有研究显示BRAF-V600E 突变的高度特异性与EGFR 酪氨酸激酶抑制剂的反应呈负相关，在组织学上往往伴有更具有侵袭性的组织学类型出现，如微乳头状癌成分［17］。研究结果显示，有3 例伴有不同数量的微乳头状癌成分，其中两例以微乳头状癌成分为主，由于缺乏相关的随访资料，无法证实其预后与野生型的差异。BRAF-V600E 突变一般预示着肿瘤更具有侵袭性，与不良预后相关［20］。因此，BRAF-V600E 可能成为NSCLC 新的治疗靶点。但对于肺腺癌BRAF基因突变的研究仅限于V600E，其他BRAF基因突变位点目前尚未能知，并且BRAF基因突变对NSCLC 治疗预测和预后的机制与作用，都值得进一步探讨。

综上所述，在靶向治疗前，多基因联合检测具有重要意义，一方面与以往的单独检测比较节约了组织并且提高了检测效率，另一面可以为NSCLC 的个体化靶向治疗提供更多的临床依据。