307例非缺失型α-地贫的基因型及血液学特征分析

冼嘉嘉 何健淳 王燕超 李少英 何文智 马晓燕 叶国新 黎青 曾军

地中海贫血（地贫，thalassemia）是一种由于珠蛋白基因突变或者缺失导致的珠蛋白链合成减少或完全缺失所引起的遗传性慢性溶血性疾病［1］。其中，α-地贫由α-珠蛋白基因缺陷所致，根据基因改变类型的不同，α-地贫可分为缺失型和非缺失型，前者是由于珠蛋白基因大片段缺失所致，是主要的突变类型，后者是由于仅珠蛋白基因或其调节序列发生点突变造成的［1-2］。广东作为地贫高发地区之一，地贫发病率达9.46%［3］，目前对于广州地区非缺失型α-地贫基因检测的报道仍然较少。本研究旨在了解该地区的非缺失型α-地贫的基因突变类型和构成比，以及相对应的临床和血液学特征，为明确非缺失型α-地贫的诊断指标，完善本地区的非缺失型α-地贫筛查提供科学的参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2014年7月至2019年6月在本院进行地贫基因检测的患者共27 502 例，其中男性12 485 例，年龄0～83 岁；女性15 017 例，年龄0～79 岁，均为广州地区患者。本研究选取其中明确诊断为非缺失型α 地贫的307 例患者作为研究对象，所有病例均排除缺铁，α 复合β-地贫和异常血红蛋白病。所有患者及家属均已签署知情同意书。本研究经过医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

血细胞分析仪（NX-9000，Sysmex，日本），全自动毛细管电泳仪（Capillarys 2 Flex Piercing，Sebia，法国），离心机（Eppendorf 5240，德国），PCR 扩增仪（ABI9700，美国），凝胶成像分析系统（Bio-rad，美国），水平电泳槽及电泳仪（Bio-rad，美国），恒温水浴箱。

1.2.2 试剂

全血基因组DNA 提取试剂盒（QIAGEN，德国），地贫基因检测试剂盒购于亚能生物技术（深圳）有限公司，试剂均为厂家原装配套试剂。

1.3 方法

1.3.1 血细胞分析

采用血细胞分析仪进行血细胞分析，送检样本在4 h 内完成检测。主要观察指标为HGB、红细胞平均体积（MCV）、红细胞平均血红蛋白含量（MCH）。

1.3.2 血清铁和血清铁蛋白分析

采用化学比色法和化学发光免疫分析法分别用于血清铁（serum iron，SI）和血清铁蛋白（serum ferritin，SF）的测定。

1.3.3 血红蛋白电泳

严格按照Capillarys 2 Flex Piercing 全自动毛细管电泳仪的说明书进行操作，分析样本各血红蛋白组分的含量。

1.3.4 基因型分析

以DNA 提取试剂盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit）提取基因组DNA。采用跨越断裂点PCR（gap polymerase chain reaction，Gap-PCR）技术检测3 种缺失型α-地贫基因突变类型（--SEA、-α3.7和-α4.2），采用PCR 结合反向杂交（PCR-reverse dot blot，PCR-RDB）技术检测非缺失型α-地贫基因3 种常见突变类型（ααWS，ααCS和ααQS），所有地贫基因诊断试剂盒均购于亚能生物技术（深圳）有限公司，具体操作按试剂盒说明进行。

1.3.5 统计学分析

使用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析。计量资料用（）表示，比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）及t检验。计数资料采用n（%）表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非缺失α-地贫基因型检测结果

在27 502 受检者中，检出307 例非缺失型α-地贫，非缺失型α-地贫的发生率为1.12%。307例非缺失型α-地贫中以ααWS/αα 最为常见，占44.63%，此外，在--SEA/ααT患者中，也以复合Hb WS最为常见，占6.51%，见表1。

表1 307 例非缺失型α-地贫基因型分布情况［n（%）］Table 1 Distribution of non-deletion α-Thalassemia genotype in 307 cases［n（%）］

2.2 常见非缺失型α-地贫血液学特征分析

3 种常见非缺失型α-地贫的杂交膜条结果（图1），血常规及血红蛋白电泳结果（图2）。男性ααWS/αα 组、ααCS/αα 组和ααQS/αα 组与男性对照组相比较，MCV、MCH 水平均有下降，差异有统计学意义（MCV：F=83.95，P＜0.05；MCH：F=153.54，P＜0.05）。女性ααWS/αα 组、ααCS/αα 组和ααQS/αα 组与女性对照组相比较，MCV、MCH 水平均有下降，差异有统计学意义（MCV：F=64.69，P＜0.05；MCH：F=80.05，P＜0.05）。男性αα/ααQS组与男性正常组比较HGB 显著性降低（t=3.272，P＜0.05），男性αα/ααCS组与男性正常组比较Hb A2 显著性降低（t=2.565，P＜0.05），女性ααCS/αα 组（Hb A2：t=17.279，P＜0.05）和ααQS/αα（HGB：t=6.295，P＜0.05）组具有同样的趋势。

2.3 --SEA/ααT及-α/ααT的血液学特征分析

--SEA/ααT及-α/ααT的血常规及血红蛋白电泳结果见图3。各组的HGB、MCV、MCH 均有下降，--SEA/ααCS的HbA2 有显著的下降，而MCV 出现增高的现象。--SEA/ααCS与--SEA/ααQS均出现血红蛋白H 及血红蛋白Bart’s，而--SEA/ααWS未发现，见图4。在--SEA/ααQS的两例患者中，有一例为新生儿。

3 讨论

非缺失型α-地贫的分子致病基础是α 珠蛋白基因或其调节序列发生单碱基置换或者存在核苷酸的缺失或插入所致，通常以αT 表示累及的基因。非缺失型a-地贫的基因型，目前已报道80 余种，常发生于α2 基因［4］，约占α-地贫的5%，αα/ααCS、αα/ααQS和αα/ααWS是我国目前发现较为常见的突变类型［5］。

本文从27502 受检者中，检出307 例非缺失型α 地贫患者，非缺失型α-地贫的发生率为1.12%。目前的文献报道有广西南宁地区［6］、清远［7］及中山［8］、厦门［9］等地方的非缺失α 地贫流行病学统计数据，清远地区报道的以ααWS/αα 检出率最高，中山地区以ααQS/αα 常见，而广西南宁及厦门则以ααCS/αα 最为常见。本研究数据显示最常见的非缺失型 α-地贫基因突变类型是 αα/ααWS（44.63%），其次是αα/ααCS（25.73%）和αα/ααQS（14.00%），与清远地区一致，但与广西南宁、中山及厦门结果存在差异，经过分析认为主要由以下几点原因导致：研究筛查的样本量存在差异，样本量少容易产生较大误差；挑选的筛查对象差异会影响阳性率，基因型频率存在明显地域差异，人群挑选的不同也导致结果不能直接进行比较。本研究针对的是在本院进行地贫筛查的所有人群，因此可补充本地区的非缺失α 地贫流行病学数据。

从血液学指标来看，αα/ααQS携带者的血液学表型相对较重些，该结果与以往报道的结果基本一致［10］。αα/ααCS是α2 基因终止密码子的突变使mRNA 转录延长至3'非翻译区，进而影响mRNA的稳定性，使其极容易被破坏；αα/ααQS是α2 基因密码子125CTG 变为CCG，导致翻译后产生高度不稳定的肽链，易被蛋白酶水解，以上突变均会让α-珠蛋白链合成量减少［2］。αα/ααWS突变也发生在α2 基因上，但其所导致的α-珠蛋白链合成减少的影响程度较低。以上分组的HGB、MCV、MCH 的结果差异说明基因突变类型对α-珠蛋白链合成减少的程度有重要影响，影响程度低则指标趋向正常的可能性大，提示我们今后要进行地贫的全面基因筛查，血液学指标的截值也需要针对各基因型进行细化以提高初筛检出率。

HbH 病分为缺失型HbH 病和非缺失型HbH病，非缺失型HbH 病比缺失型导致更严重的a 珠蛋白链合成的减少，因此临床表现更为严重。Chanchai Traivaree 等［11］报道过，在泰国人群中，非缺失型HbH 病患者的血液学表现比缺失型HbH病患者的血液学表现严重。本文统计了3 种非缺失型HbH 病的类型，--SEA/ααQS的临床表现相对较重。三种非缺失型HbH 病的临床特征与《地贫预防控制操作指南》［10］一致。但目前本研究未发现ααCS/ααCS、ααCS/ααQS及ααQS/ααQS的纯合子患者，部分特殊基因类型样本量较少，未能全面涉及，不足以反应该类人群血液学情况，有待扩大样本量进行验证分析，以丰富数据多态性。

总的来说，在非缺失型α-地贫筛查中，我们应密切留意受检者的MCV 值和MCH 值及血红蛋白电泳结果，以提示疑似携带者做进一步基因检测。