脐带间充质干细胞外泌体对大鼠肾间质纤维化的抑制作用

胡玉燕， 尹磊， 张晨笑， 钱晖

(江苏大学医学院， 江苏 镇江 212013)

肾间质纤维化几乎是所有慢性肾脏病进展到终末期的病理损伤过程，其主要发生机制为正常伤口愈合的病理性扩展，表现为肌成纤维细胞活化，细胞外基质成分过度沉积以及炎性细胞的大量浸润[1]。目前临床研究中发现一些抗纤维化剂可有效降低甚至逆转纤维化，但针对人类有效的抗纤维化治疗方法仍受到限制[2]。因此，缓解肾脏纤维化是迫切需要解决的一大难题。

外泌体(exosomes)是由细胞分泌的一类直径在30～200 nm的膜性囊泡，富含蛋白质、核酸和脂质等，在细胞外环境中进行信号和分子的交流传递[3]。课题组前期研究发现，人脐带间充质干细胞来源外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes，hucMSC-Ex)在肝纤维化、炎性肠病、烫伤皮肤创面愈合、急慢性肾损伤等多种疾病模型中发挥修复作用[4-7]。我们前期研究发现hucMSC-Ex可抑制转化生长因子-β1(transforming growth factor beta-1，TGF-β1)诱导的大鼠肾小管上皮细胞上皮间质转化(EMT)[8]，然而，hucMSC-Ex在肾间质纤维化中能否发挥作用尚不清楚。在此基础上，本研究拟采用单侧输尿管结扎法模拟体内单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)导致的肾脏纤维化，探讨hucMSC-Ex在大鼠肾纤维化过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

α-MEM培养液、特级胎牛血清(以色列Bioind公司)；100 kDa MW CO 超滤离心管(MBI公司)；外泌体提取试剂(美国SBI公司)；细胞蛋白质裂解液RIPA和酶抑制剂(美国Pierce公司)；鼠抗人CD9单克隆抗体、兔抗人CD63多克隆抗体及兔抗人CD81多克隆抗体(美国Proteintech公司)；兔抗人β-肌动蛋白多克隆抗体、兔抗人TGF-β1多克隆抗体(美国Bioworld公司)；鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体(博士德公司)；兔抗人波形蛋白单克隆抗体、兔抗人N-钙黏蛋白多克隆抗体(美国CST公司)；兔抗人E-钙黏蛋白多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；羊抗鼠IgG二抗、羊抗兔IgG二抗、驴抗兔IgG荧光二抗(美国Invitrogen公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)； 细胞超净台(苏州净化设备厂)；透射电子显微镜(荷兰Philips公司)；ImageQuant LAS400mini化学发光成像仪(日本GE公司)；倒置式生物显微镜(日本Nikon公司)；免疫组织化学染色试剂盒、Masson 染色试剂盒(博士德公司)；超声波破碎仪(美国Branson公司)。

1.2 hucMSC-Ex收集、提取和鉴定

脐带标本来源于江苏大学附属四院。根据本实验室前期建立的脐带间充质干细胞培养及外泌体提取方法[9]，收集对数生长期hucMSCs的培养上清液。超滤浓缩上清液，加入外泌体提取试剂沉淀，获得hucMSC-Ex，透射电镜观察外泌体形态，蛋白质印迹检测外泌体表面标志CD9、CD63和CD81及纳米流式检测粒径大小，分装保存于-80 ℃。

1.3 UUO模型及治疗模型构建

SD雄性大鼠购于江苏大学实验动物中心，体重180～200 g。按随机数字表法分为假手术组、UUO 组和hucMSC-Ex组，每组6只。UUO组大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，经腹部左侧开口，找到输尿管后用4-0手术缝合线进行结扎，之后用2-0手术线进行缝合。假手术组在找到输尿管后不做处理，直接缝合。hucMSC-Ex处理组在术后24 h尾静脉注射250 μg hucMSC-Ex，之后每隔2 d注射1次，共计3次。7 d后处死大鼠，摘取左侧肾脏，用PBS洗净，将肾脏横切一分为二，一半置于4%多聚甲醛固定，用于组织石蜡包埋切片；一半置于-80 ℃保存用于蛋白质检测。

1.4 Masson染色观察肾组织胶原沉积

肾组织石蜡切片首先于65 ℃ 烘箱烤片6 h，依次放入二甲苯15 min/次×2次，100%、95%、90%、80%、75%、70%乙醇各2 min脱蜡，流水冲洗。0.5%碘酒溶液10 min，水洗；0.5%硫代硫酸钠溶液处理5 min，水洗；30%饱和苦味酸乙醇溶液固定30 min，水洗；苏木素染核10 min，充分水洗；玻片烘干后滴加丽春红酸性复红染色液，室温20 min，0.2%冰醋酸水溶液清洗玻片；磷钼酸水溶液分化处理2 min，甩干后苯胺蓝染色5 min；冰醋酸水溶液洗涤。脱水过程为脱蜡的逆过程，方法如上，最后用中性树脂封片，镜下观察。

1.5 HE染色观察肾组织形态结构

石蜡切片脱蜡至水，苏木素染核5 min，充分水洗；甩干后滴加1%盐酸乙醇作用30 s，弃掉溶液后直接滴加1%氨水30 s返蓝，充分水洗；0.5%伊红染液染色90 s，水洗。最后对切片进行脱水处理，中性树脂封片镜下观察。

1.6 免疫组织化学和免疫荧光染色观察肾组织内纤维化相关蛋白表达

石蜡切片脱蜡脱水过程同上。3% H2O2室温孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶，组化PBS洗涤3次；枸橼酸盐缓冲液蒸煮30 min进行抗原修复，洗涤3次；然后用5% BSA室温封闭1 h，甩干后直接孵育一抗，一抗稀释比α-SMA(1 ∶ 100)，TGF-β1(1 ∶ 100)，4 ℃孵育过夜，洗涤3次；滴加二抗，室温孵育30 min，洗涤；滴加SABC，37 ℃ 30 min，洗涤；最后，每张切片滴加DAB显色剂，镜下显色5～10 min，待组织切片出现棕黄色阳性区域后用蒸馏水终止，苏木素染核20 s，流水冲洗后，脱水封片，镜下观察。

脱蜡及孵育一抗同上，一抗稀释比例E-钙黏蛋白(1 ∶ 100)、N-钙黏蛋白(1 ∶ 100)。随后加入 FITC标记的羊抗兔二抗，37 ℃湿盒放置45 min，PBS 洗涤4次，每次5 min；加入Hoechst避光染5 min，PBS 洗涤4次，每次5 min。甘油封片后，荧光显微镜观察拍照。

1.7 蛋白质印迹检测肾脏纤维化相关蛋白

取1 g肾脏组织加入150 μL蛋白裂解液，超声波破碎细胞提取组织蛋白。配制12% SDS-PAGE分离胶，以180 μg上样。80 V恒压电泳至目的条带分离。350 mA恒流转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭1 h后孵育一抗，β-肌动蛋白稀释比为1 ∶ 2 000，TGF-β1、波形蛋白、E-钙黏蛋白稀释比均为1 ∶ 500。4 ℃孵育过夜，1×TBST洗涤。加入HRP标记的驴抗兔抗体(1 ∶ 2 000)，37 ℃孵育1 h，洗涤。洗涤后采用化学发光成像仪进行凝胶成像。

2 结果

2.1 hucMSC-Ex的观察和鉴定

实验提取的hucMSC-Ex经电子透射电镜观察，外泌体为盘状囊泡(图1A)；粒径分布在50～200 nm之间，主要集中在110 nm左右(图1B)；蛋白质印迹检测显示hucMSC-Ex表达标志分子CD9、CD63和CD81(图1C)。

A：透射电子显微镜观察hucMSC-Ex形态；B：纳米流式技术分析hucMSC-Ex粒径分布；C：蛋白质印迹检测hucMSC-Ex表面标志

2.2 hucMSC-Ex 对UUO大鼠肾脏结构的影响

SD大鼠结扎7 d，肉眼可见左侧肾脏明显肿大，近肾端输尿管充盈大量炎性液体，并且与周围组织粘连严重。经尾静脉注射hucMSC-Ex干预后，肾脏外观与UUO组相比有明显改善，外观鲜红，表面瘀血减少，坏死区域较少(图2)。

HE染色结果表明，UUO组大鼠肾脏基本结构消失，大量成纤维细胞增生；hucMSC-Ex组大鼠肾脏结构有所改善，肾小管萎缩得到缓解，炎性因子浸润和成纤维细胞增生减少，坏死区域有所减缓(图3)。Masson染色结果显示，假手术组肾脏组织无明显的胶原沉积；UUO组中有被染成蓝色的片状阳性区域，且多分布在肾小管周围，表明有大量的胶原纤维沉积在肾间质；hucMSC-Ex组大鼠肾脏组织蓝色区域明显减少，成条索状分散在少数肾小管周围(图4)。以上结果证明hucMSC-Ex能在UUO诱导的大鼠肾间质纤维化中发挥抑制作用，改善肾脏结构，减少胶原沉积，延缓肾纤维化进展。

图2 输尿管结扎7天大鼠左肾横切面观察

图3 HE染色观察大鼠肾脏组织结构(×400)

图4 Masson染色观察大鼠肾脏组织胶原沉积(×400)

2.3 hucMSC-Ex对UUO大鼠肾脏组织EMT的影响

免疫组织化学检测α-SMA和TGF-β1在肾组织内的表达，UUO组病变部位有大量的棕黄色阳性颗粒沉积，而hucMSC-Ex组阳性区域明显减少(图5)。蛋白质印迹显示，UUO组TGF-β1和波形蛋白的表达高于假手术组，而E-钙黏蛋白表达下调；hucMSC-Ex组TGF-β1和波形蛋白的表达减少， E-钙黏蛋白含量上调(图6)。免疫荧光检测结果显示hucMSC-Ex能够增加E-钙黏蛋白表达，减弱N-钙黏蛋白表达(图7)。结果表明hucMSC-Ex能够抑制肾间质中TGF-β1等促纤维化因子的表达，并且能够逆转EMT，从而起到保护肾脏的作用。

图5 免疫组化检测各组大鼠肾组织α-SMA 和TGF-β1的表达(×400)

3 讨论

干细胞来源的外泌体以其免疫原性低、稳定、可量产等诸多优势，在免疫调节、抗炎和抗纤维化、增强血管再生等方面发挥了重要作用[10]。本研究探讨hucMSC-Ex对大鼠肾间质纤维化的作用，结果显示hucMSC-Ex干预后炎性因子浸润减少，肾间质空泡变性好转，肾小管结构较清晰，提示hucMSC-Ex能够有效缓解输尿管梗阻引起的肾脏炎症和纤维化的进展，改善肾脏的功能。

图6 蛋白质印迹检测各组大鼠肾组织TGF-β1及EMT指标

图7 免疫荧光检测肾脏组织E-钙黏蛋白(×400)和N-钙黏蛋白(×200)表达

TGF-β信号通路作为关键介质参与器官纤维化进程，其中TGF-β1被认为是炎症性疾病转变至纤维化的重要细胞因子[11-12]。研究发现，骨髓来源的外泌体可以通过下调TGF-β1调节受损子宫内膜的纤维化修复[13]。本研究中大鼠输尿管梗阻后引起肾组织TGF-β1和α-SMA高表达，hucMSC-Ex处理后能够下调纤维化相关蛋白TGF-β1、α-SMA和波形蛋白的表达。此外，肾小管细胞在损伤状态下能够发生EMT，并通过旁分泌方式显著地促进炎症和纤维形成[14]。损伤发生后，炎症性细胞因子、机械应力或化学(激素类)物质会刺激EMT，研究发现，hucMSC-Ex能够抑制CCL4诱导的肝纤维化中的EMT发生[15]。我们的结果显示，在UUO模型中波形蛋白的表达水平增加，E-钙黏蛋白含量下调，hucMSC-Ex干预能够促进E-钙黏蛋白的表达，抑制波形蛋白的表达。由此表明，hucMSC-Ex可能通过TGF-β信号通路逆转EMT从而延缓肾间质纤维化，提示hucMSC-Ex干预可能成为缓解甚至治疗肾间质纤维化的一种新型疗法。

干细胞外泌体是干细胞旁分泌的一类囊泡，内部包裹多种干细胞独特的基因产物和大量的miRNAs，参与细胞通讯，维持组织内稳态，其中外泌体miRNAs信号传递被认为是细胞间通讯新的方式[16]。研究发现过表达miR-let-7c的工程化骨髓间充质干细胞能够归巢到受损的肾组织并上调miR-let-7c，同时外泌体中摄取大量miR-let-7c抑制TGF-β1受体有效地发挥体外抗纤维化作用[17]。另外肌内注射过表达miR-29的外泌体能够有效缓解UUO诱导的肾纤维化，减少肾脏组织中TGF-β、α-SMA和胶原的表达[18]。为了探索外泌体miRNAs的治疗效果，课题组开展了hucMSC-Ex的miRNAs测序，生物信息学分析显示在hucMSC-Ex中存在大量高表达的miRNAs分子。我们将在后续研究中探究是否存在抑制肾纤维的特异性功能miRNAs，对hucMSC-Ex在肾脏纤维化中抑制TGF-β1逆转EMT的具体机制作进一步探讨。

综上所述，本研究显示hucMSC-Ex能够有效延缓大鼠UUO导致的肾纤维化，但其是否能够抑制人类肾脏纤维化还有待进一步证实。另外，本实验针对的是肾脏纤维化进展前期的干预性治疗，对衰竭中晚期的肾脏是否有缓解作用还需进一步实验。