鸡前等级卵泡中RAC1基因的表达

秦 宁

(吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118)

产蛋性状是鸡的重要经济性状之一，其主要决定于鸡卵巢中被募集的前等级卵泡的数目、发育程度、优势卵泡选择和等级化的建立。而卵泡发育是一个高度调节、严格等级化的复杂调控过程，此过程除了受到下丘脑-垂体-性腺轴(HPG axis)激素的调控外，还受到许多生长因子、细胞因子、转录因子和信号通路等不同方式的调节。鸡RAC1基因位于14号染色体上，共有7个外显子，编码211个氨基酸构成的蛋白质分子。RAC1(ras-related C3 botulinum toxin substrate1)作为小G蛋白Rho亚家族中的一员，具有GTPase结合区，与GTP结合时被激活生物学活性，与GDP结合时失活，在体内发挥分子开关的作用[1]。近年研究显示RAC1分子还在调节细胞增殖分化、调控细胞骨架、参与基因转录和信号转导的过程中发挥重要作用[2-4]。然而，尚未见RAC1与鸡前等级卵泡关系的研究报道。

本研究以150日龄的海兰褐蛋鸡前等级卵泡组织为素材，采用半定量RT-PCR和免疫组化的方法对RAC1分子的表达特性进行分析。结果表明，RAC1 基因在鸡卵巢不同发育阶段的前等级卵泡中均有表达，且随着前等级卵泡颗粒细胞的增殖与分化，RAC1基因mRNA的表达呈现出逐渐上升的趋势，在直径6～8 mm 的卵泡中表达量最高，且RAC1 蛋白分子在不同发育阶段的前等级卵泡中的卵母细胞、颗粒细胞以及膜层细胞中均有表达，初步揭示RAC1在mRNA水平和蛋白水平参与前等级卵泡的发育调控。通过分析鸡RAC1分子在前等级卵泡中的时空表达特性和定位，可为进一步研究RAC1在鸡卵泡发育中的生物学功能提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物本研究拟选择饲养环境、营养水平相同的海兰褐蛋鸡20只，采取笼养的饲养方式，每天8 h 光照(8L∶16 D)，自由采食和饮水。于150日龄，用乙醚将母鸡麻醉后断颈处死，迅速采集卵巢组织中前等级卵泡(直径1～3.9，4～5.9，6～8 mm)，一部分放于液氮中冷冻保存，用于RNA的提取；一部分放入4%的多聚甲醛溶液中进行固定，备用。

1.2 主要试剂RNA 提取试剂盒(Code:DP431)购自天根，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Code:RR047A)购自宝生物，Rabbit polyclonal to RAC1(Abcam)、HRP标记的羊抗兔二抗(博士德)， DAB染料、石蜡、二甲苯等均购自天根公司。

1.3 RNA的提取本研究使用RNA提取试剂盒(天根)，提取直径1～3.9,4～4.9，5～8 mm的前等级卵泡RNA，然后用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，测定其D值并检验其纯度，调整各组织样总RNA浓度至2 g/L分装于―70℃备用。

1.4 引物设计与合成根据GenBank中RAC1(NM_205017.1)和18S rRNA(FM165414.1)基因的mRNA为模板，用Primer5.0软件设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 RT- PCR 引物及PCR 扩增产物长度

1.5 RT-PCR扩增

1.5.1cDNA的合成 在0.2 mL的PCR管中加入提取的总RNA 1.0 μg，5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，加Rnase-free ddH2O至10.0 μL得试剂Total 1，再在试管中加入Total 1 10.0 μL，反转录酶1.0 μL，5×PrimeScript 缓冲液24.0 μL，反转录引物1.0 μL，Rnase-free ddH2O 4.0 μL。轻轻混匀，37℃ 15 min，85℃ 5 s，反应完成，cDNA 第一链合成。合成的cDNA保存于-20℃备用。

1.5.2PCR反应 以反转录合成的cDNA为模板，分别PCR扩增RAC1和18S rRNA基因的目的片段。先通过预实验确定最佳循环数，采用50 μL体系，加入cDNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，18S rRNA 上、下游引物(10 μmol/L) 各1 μL，2×EasyScriptTMHiFiPCRSuperMixⅡ 37 μL,最后加入双蒸水5 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；(94℃ 30 s，54℃ 30 s， 72℃ 30 s)，72℃ 延伸7 min，36个循环。降温至4℃停止反应后保存于-20℃。

1.6 琼脂糖凝胶电泳检测取PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像仪上观察并拍照。利用系统软件ImageJ2x和BandScan5.0进行吸光值比较分析，确定目的基因在组织样品中表达量的相对值，每个条带图重复测3次，取平均值。

1.7 石蜡切片的制备取固定好的前等级卵泡组织样本，切成小方块，在二甲苯中脱水，进行透明处理30 min； 60℃恒温水浴锅中浸泡，分别为两次软蜡和两次硬蜡；包埋、切片机切片，厚度大约5 μmol/L，切好的薄片在45℃的温水中浸泡大约2 min，取出后放于摊烤机中，烘干备用。

1.8 免疫组织化学检测将制备好的石蜡切片放在60℃恒温箱中60 min，进行脱蜡，把切片放入100%,95%,85%,75%的酒精和ddH2O中分别浸泡5 min，取出后清洗3次。然后把切片放入盛有10 mmol/L的枸橼酸盐缓冲液的压力锅中，煮沸4 min 后取出，用ddH2O和PBST(PBS溶液与表面活性剂Tween-20的混合液)清洗后血清处理封闭。加入用3% BSA-PBST稀释的一抗，在4℃湿盒中孵育过夜，再室温复温60 min，再加入酶标二抗，室温孵育60 min，再滴加DAPI避光孵育5 min，用DAB染色，封片。最后用OLYMPUS BX53型显微镜观察结果。

2 结果

2.1 总RNA所有样品提取的总RNA，A260/A280的比值均在1.8～2.0，且28S，18S 2条带明显可见(图1)，表明所提取的RNA纯度高、无降解，可用于mRNA的表达谱分析。

图1 总RNA提取结果 1～3.依次为1～3.9,4～5.9,6～8 mm

2.2 RAC1基因在鸡前等级卵泡组织中表达特性分析经PCR扩增序列测序比对，RAC1基因的扩增片段为232 bp,以18S RNA基因为内参，通过半定量RT-PCR实验，对鸡RAC1基因mRNA在前等级卵泡中的相对表达量进行分析，结果如图2所示，RAC1基因在鸡不同直径的前等级卵泡内均有表达，但表达丰度存在一定的差异。其中在直径6～8 mm 的卵泡中相对表达量最高(P<0.05)，为3.68，其次为直径4～5.9 mm的卵泡，相对表达量为1.58，而在直径1～3.9 mm卵泡中最低(P<0.05)，为1.21。结果表明，随着鸡前等级卵泡的增殖分化，RAC1基因mRNA的表达呈现逐渐上升的趋势，初步揭示了该基因在mRNA转录水平参与了前等级卵泡的发育调控。

图2 鸡RAC1基因mRNA在前等级卵泡中的表达 M.DL2000 Marker;1～3.依次为1～3.9,4～5.9,6～8 mm

2.3 RAC1蛋白在鸡前等级卵泡组织中的定位RAC1蛋白在鸡前等级卵泡中的定位情况如图4所示，由图A、B、C可见，在不同发育阶段的前等级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中，均有明显的棕黄色着色，呈较强的阳性信号；而在膜层细胞中也有棕黄色着色，但是阳性信号不明显。图D为阴性对照，全图呈蓝色，无棕黄色着色，即无免疫阳性信号。此结果说明RAC1蛋白主要在不同发育时期的前等级卵泡中的卵母细胞、颗粒细胞和膜层细胞中表达，但RAC1蛋白主要分布细胞质中，且在卵母细胞和颗粒细胞的免疫阳性信号较强。

图4 RAC1蛋白在鸡卵巢前等级卵泡上(直径1～8 mm)的定位 OC.卵母细胞;GC.颗粒细胞;TC.膜层细胞

图3 RAC1基因mRNA在鸡前等级卵泡中的相对表达量 字母不同表示显著差异(P<0.05)

3 讨论

鸡卵泡的发育模式明显区别于其他动物，具有连续发育、等级排列和优势选择等特点。卵泡按直径大小分为前等级卵泡(直径1～8 mm)和等级卵泡(排卵前卵泡 9～40 mm)。卵泡经过优势选择，在前等级卵泡的小黄泡(SYF)阶段，大多数卵泡闭锁或被吸收，只有少数卵泡(1～2个)进入等级化阶段，说明被选择进入等级化的卵泡数目越多，产蛋性能越高[5-6]。因此，前等级卵泡的发育程度和被选择的卵泡数目是决定母鸡产蛋能力的关键因素。为什么前等级卵泡中只有少数卵泡(1～2个)可以进入等级化阶段，而这一过程中哪些因子起了调控作用，尚未有明确解析。研究探讨调控鸡卵巢前等级卵泡发育的相关分子，对于揭示鸡产蛋性状形成的遗传机理具有重要的理论价值和经济意义。

小G蛋白RAC1具有GTPase结合区， SLIT/ROBO通路偶联的RhoGAP结构域可通过刺激Rho家族蛋白内在的GTP水解酶活性，抑制小G蛋白RAC1的活性[7]。SLIT/ROBO通路是一个神经内分泌信号转导调节途径，在动物的卵泡发育过程中发挥重要调控作用[8]，此表明，RAC1作为SLIT/ROBO通路的下游效应分子，可能在调控鸡前等级卵泡发育中发挥重要作用。

有研究表明，RAC1参与调控基因表达，调节细胞增殖分化等过程[9-10]，本研究通过半定量RT-PCR实验证实了RAC1基因存在于鸡卵巢卵泡中，并在鸡不同直径大小的前等级卵泡中均有表达，此结果表明，在鸡前等级卵泡组织中， RAC1基因可能参与或维持前等级卵泡的正常生长发育。直径6～8 mm的卵泡是优势卵泡选择和等级化发育阶段的关键转折点，而 RAC1基因mRNA的表达量在此期间波动幅度较大，显著高于其他阶段(P<0.05)，说明RAC1基因在前等级卵泡的发育中一定以某种方式发挥作用。同时也提示，该基因与卵泡闭锁和优势卵泡选择有着密切的关系，这也是我们对RAC1基因在前等级卵泡中的时空表达模式进行深入研究的原因之一，但其更具体详尽的调控机制还有待研究。

在卵泡生长发育的过程中，卵泡中卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞之间的相互作用是卵泡发育成熟和维持正常功能的重要条件，也是一个复杂的调控网络。而调节卵泡发育的靶细胞颗粒细胞和卵母细胞，两者之间高度协调互作，不断进行信息交流。卵母细胞会产生信号维持颗粒细胞发育，但当卵母细胞生长到一定程度时，就会抑制颗粒细胞对卵母细胞生长的促进作用[11-13]。为进一步探讨RAC1分子在前等级卵泡中如何定位及可能发挥的调控作用，本实验采用免疫组化的方法对RAC1蛋白进行定位研究，结果可见，鸡RAC1蛋白质分子主要在卵母细胞、颗粒细胞和膜层细胞中表达分布，且主要存在于细胞质。说明RAC1不仅参与了调节鸡卵巢前等级卵泡的增殖分化，也可能与颗粒细胞和卵母细胞之间的信息交流密切相关。有研究报道，RAC1蛋白在人类卵巢和鸡卵泡中均有表达，可通过促进GDF9和BMP15的转录来调节小鼠原始卵泡的形成，受RAC1调控的GDF9与BMP15可以通过旁分泌的方式作用于前体颗粒细胞[14]。而RAC1蛋白的表达定位可能是由于卵巢间质相关细胞自分泌，即自我表达RAC1蛋白，或者也是通过旁分泌的方式，不同卵泡间进行的调节表达，具体的作用方式及与各细胞之间的关系还需进一步深入研究。

本研究采用了半定量RT-PCR方法对RAC1基因在鸡卵巢不同直径大小的前等级卵泡中mRNA转录水平进行了检测，结果表明RAC1基因在鸡不同直径的前等级卵泡内均有表达，但表达丰度存在一定的差异，在直径6～8 mm卵泡中相对表达量显著高于直径4～5.9,1～3.9 mm卵泡(P<0.05)，表明RAC1基因在mRNA水平调控鸡前等级卵泡过程中发挥着关键作用。为进一步探讨RAC1蛋白分子的定位，采用免疫组织化学的方法对RAC1蛋白在前等级卵泡的表达模式进行蛋白质定位研究，结果显示，RAC1蛋白主要在卵母细胞、颗粒细胞和膜层细胞中表达分布，但膜层阳性信号较弱，进而说明RAC1在前等级卵泡的发育中可能发挥着重要作用。此结果为进一步研究RAC1在鸡卵泡发育中的作用奠定了理论基础。