牛冠状病毒、牛诺如病毒和牛嵴病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

王文佳，徐照学，兰亚莉*，师志海*

(1.河南牧业经济学院 制药工程学院，河南 郑州 450046；2.河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；3.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002)

犊牛腹泻(calf diarrhea，CD)是一种影响犊牛健康，进而影响优质畜产品生产的严重病症。在美国，CD是断奶前犊牛死亡的首要原因[1]，韩国[2]、伊朗[3]等国也有类似报道。CD给全球养牛业带来巨大经济损失[4]。近年来，随着我国养牛业规模的扩大，CD的发病率呈上升趋势，严重影响犊牛早期的生长发育和后期生产性能的发挥。同时，因其死亡率高，亦严重影响牛群的更新和养牛业的良性发展[5]。此外，在CD的防治过程中，大多以抗生素治疗为主，易产生耐药性及畜产品药物残留超标的问题[6]。另外，受病原感染的牛提供给人类的乳、肉制品，会成为人类感染某些病原的潜在传播媒介，给人类的生命健康和公共卫生安全带来实质性威胁[7]。

CD病因复杂，包括细菌、病毒、真菌、寄生虫以及环境等其他生物学因子，给临床防制带来了极大地困难。尽管说细菌、病毒、寄生虫等都可引起CD，但病毒可通过急性、持续性或潜伏性感染引起腹泻类疾病[5]，在CD中扮演重要角色。近年来，特别是对与CD相关病毒的研究日益受到全球病毒学界及相关领域专家学者的青睐，并成为研究热点。牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCoV)是冠状病毒科、冠状病毒属的单股正链RNA病毒，可引起CD、成年牛冬痢和呼吸道疾病。犊牛感染多发于5～30日龄。牛诺如病毒(bovine norovirus，BNoV)是杯状病毒科、诺如病毒属的无囊膜单股正链RNA病毒。1978年首次在英国腹泻犊牛的粪便中被发现[9]，2018年首次在我国腹泻牛粪便中被检测到[10]。牛嵴病毒(bovine kobuvirus，BKV)，又名Aichivirus B，是无囊膜的RNA病毒。2003年首次在健康牛血清和粪便中被发现[11]，2008年在腹泻牛粪便中被检测到[12]，2013年首次在我国西北部地区奶牛群中检测到[13]。关于BNoV和BKV的流行病学在我国尚无相关报道，以及BKV在CD中扮演的角色还存在争议，有待于更多的研究求证。基于此，本试验建立BCoV、BNoV和BKV多重PCR检测方法，并在河南部分地区规模化牛场采集样品进行检测，以期为BCoV、BNoV和BKV的疫情监控、临床检测、综合防控及分子流行病学研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料2017年9月—2018年5月，127份腹泻犊牛(<4月龄)粪便样本采集自河南规模化牛场(表1)，全部样品单独分装，详细记录品种、年龄、采样日期、样品数量等信息。牛冠状病毒(BCoV)、牛诺如病毒(BNoV)、牛嵴病毒(BKV)、牛星状病毒(bovine astrovirus,BAstV)、牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛纽布病毒(bovine nebovirus,BNeV)阳性样品均由本实验室鉴定保存。

表1 样品信息

MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit，PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，Premix Taq，DNA Marker 2000，pMD 18-T，DH5α均为TaKaRa公司产品；Gel Extraction Kit，Plasmid Mini Kit均为OMEGA公司产品。

1.2 核酸提取127份粪便样品，用PBS 按1∶10混悬，漩涡震荡，4℃ 8 000 r/ min离心5 min，收获上清，-80℃保存用于后续实验。病毒RNA的提取参照提取试剂盒，-80℃保存病毒RNA；cDNA的反转录参照逆转录试剂盒，-20℃保存。

1.3 引物设计与合成根据GenBank上发表的BCoV和BNoV病毒基因的保守序列，利用Premier 5.0软件对该2种病毒的基因保守区域分别设计1对引物，预计扩增BCoV NSP1-2 基因部分片段896 bp，BNoV RdRp基因部分片段542 bp；BKV的引物参考其他文章[14]，扩增BKV 3D基因部分片段216 bp。引物由华大基因生物科技有限公司合成，引物信息见表2。

表2 引物信息

1.4 PCR扩增对多重PCR反应的引物、模板等用量进行优化和多次重复试验后确定最佳反应体系。将反应退火温度从45～56℃依次递增，多次重复试验后确定最佳退火温度。每次设置阴性对照。PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

1.5 特异性试验用建立的多重PCR方法对BCoV,BNoV,BKV,BRV,BAstV,BVDV,BNeV进行检测。

1.6 敏感性试验用上述引物分别对BCoV、BNoV和BKV的阳性样品进行单一PCR扩增，回收PCR扩增产物，分别与pMD18-T载体连接，构建阳性质粒。用超微量核酸蛋白分析仪测定所构建的阳性质粒的浓度，计算模板质粒的拷贝数，将阳性质粒10倍梯度稀释后进行多重PCR的敏感性试验。

1.7 重复性试验以构建的阳性质粒为模板，用建立的多重PCR方法每隔1周重复检测1次，连续检测3次，以验证该方法的可靠性和重复性。

1.8 应用性试验用所建立的多重PCR方法对127份临床腹泻粪便样本进行检测，并与用单一PCR检测结果进行比较。

2 结果

2.1 多重PCR体系的构建及优化通过对退火温度及引物浓度等条件的优化，最终确定该多重PCR体系包括Premix Taq 10 μL，BCoV，BNoV和BKV的上/下游引物各0.25 μL，模板1 μL，无菌去离子水补足至20 μL。退火温度最佳为52℃，最佳反应条件为：94℃ 5min；94℃ 1 min，52℃ 1 min,72℃ 1.5 min，30个循环；72℃ 7 min。

以BCoV，BNoV和BKV的单一模板和混合质粒为模板，用建立的多重PCR同时扩增，以ddH2O做阴性对照。结果显示，多重PCR分别扩增出BCoV约896 bp，BNoV约542 bp和BKV约216 bp 大小的目的片段(图1)。所有扩增出的特异性目的片段均经过测序验证。

图1 BCoV、BNoV、BKV单一和多重PCR扩增 M.DL2000 DNA Marker;1.BCoV、BNoV和BKV的多重PCR扩增产物;2.BNoV单一PCR产物;3.BCoV单一PCR产物;4.BKV单一PCR产物;5.阴性对照

2.2 特异性试验用建立的多重PCR方法检测不同的阳性样品。结果表明，本试验建立的多重PCR方法具有良好的特异性(图2)。

图2 多重PCR的特异性 M.DL2000 DNA Marker;1.BCoV,BNoV 和 BKV多重PCR扩增;2～8.分别是BNoV,BKV,BCoV,BRV,BAstV,BVDV,BNeV的PCR产物;9.阴性对照

2.3 敏感性试验结果显示，用建立的多重PCR方法对BCoV，BNoV和BKV的最低检测限分别为9.51×105，5.39×105和2.23×106copies/μL(图3)。

图3 多重PCR的敏感性 M.DL2000 DNA Marker;1～8.108～101 copies/μL BCoV+108～101 copies/μL BNoV+109～102 copies/μL BKV;9.阴性对照

2.4 重复性试验用建立的多重PCR方法对同一模版进行检测，3次试验结果一致(图4)，表明该方法重复性良好。

图4 多重PCR的重复性 A,B,C.分别代表第1,3和5周的PCR M.DL2000 DNA Marker;1.BCoV+BNoV+BKV;2.BNoV;3.BCoV;4.BKV;5.阴性对照

2.5 应用性检测用建立的多重和单一PCR对127份临床样品进行检测，部分临床样品检测结果见图5。结果显示，所建立的多重PCR方法检测出的BCoV，BNoV和BKV的阳性数分别为19份(阳性率为14.96%)，8份(阳性率为6.30%)和6份(阳性率为4.72%)；并检出BCoV、BNoV和BKV共感染的样品2份(阳性率为1.57%)(表2)。检测结果与单一PCR检测结果符合率为100%。表明该方法能够快速准确的检测此3种病毒。

图5 部分临床样品的检测 M.DL2000 DNA Marker;1～15.临床样品;16.阴性对照

3 讨论

CD病因复杂，找出致病原因，做出准确诊断，采取相应措施是成功控制CD的关键。然而，在过去很长一段时间，有关CD的病原学调查都局限在细菌领域。近年来，关于病毒性病原在CD病因中的角色与地位越来越多的受到各国学者的关注，逐渐成为全世界病毒学界及相关领域专家学者的研究热点[15-16]。近年来，BKV和BNoV等病毒在我国牛群中陆续被检测到，应引起我国相关领域专家学者的关注和重视。目前，在我国关于BKV和BNoV的流行状况、致病力以及分子遗传进化分析等方面的相关报道甚少，本试验建立的检测方法为弥补此空白提供可靠的技术手段。

表3 临床样品的检测结果

BCoV,BNoV和BKV均与CD有关[17]，并且三者有可能被同时检测到，仅靠临床鉴别诊断难以判定，从而给疾病的及时防治带来不便。传统的病毒检测方法如电镜观察、病毒分离鉴定、血清学试验等，存在费时费力、特异性差、试验周期长等不足，准确快速的诊断技术对此3种病毒的检测显得尤为重要。多重PCR技术可同时检测多种病原体，在鉴别诊断上应用价值较大，尤其是混合感染[18]。本试验建立的多重PCR诊断方法，可同时检测此3种病毒。运用该方法检测其他能够引起CD的病毒性病原，均无条带，说明特异性良好。另外使用该方法对BCoV,BNoV和BKV的模板(1 μL)最低能检测到3.74 pg的BCoV,1.91 pg的BNoV和7.10 pg的BKV，敏感性较高。该方法可用于临床样品中BCoV，BNoV和BKV的快速检测。用所建立的多重PCR方法对127份CD粪便样品进行检测，其中，BCoV、BNoV和BKV的检出率分别为14.96%，6.30%，4.72%。本试验中BKV的检出率低于CHANG等[13]报道的检出率(34.9%)，可能与样本数量、饲养管理、生态条件等因素有关。

本试验通过优化多重PCR的反应条件，建立的BCoV，BNoV和BKV多重PCR检测方法，能从粪便样品中成功检测出BCoV，BNoV和BKV，特异性强，敏感性高，重复性好，可为此3种病毒的快速检测和流行病学调查等研究提供有力的技术支持。