河北省 PEDV 流行毒株的分离鉴定及遗传演化分析

辛树阳，严世杰，宋 涛，郝建香，付琦媛，李文傲，王春芳，回卫荣，唐梦虎，马增军，芮 萍

(河北科技师范学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛 066600)

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea,PEDV)引起的一种以急性肠胃炎、水样腹泻、呕吐、消瘦和脱水为主要特征的急性、接触性肠道传染病[1]。各年龄段猪对该病毒均易感，表现出不同的临床症状，1周内哺 乳仔猪感染尤为严重，发病率极高，病死率可高达50%～90%[2-3]。

1984年，我国首次发现PEDV[4-5]，此后，我国猪场一直存在PEDV感染，但多呈零星分布或地域性流行，并未造成大规模流行。直至2010年10月，我国华南地区部分猪场开始暴发大规模PED流行，导致数百万头仔猪死亡，短时间内疫情迅速扩散至全国，甚至在疫苗免疫猪场也有PED疫情暴发[6]，随后经病毒全基因组测序证实，引起PED疫情暴发的原因是PEDV 流行毒株发生变异[7]，此后PED在我国普遍流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。

本研究收集了2017—2018年河北省疑似感染PEDV的临床病料，通过RT-PCR、细胞培养、测序等进行病毒分离鉴定，并利用DNAstar、 MEGA 6.0等软件与GenBank公布的国内外PEDV参考毒株进行同源性比对和遗传进化分析， 以期揭示河北省PEDV的流行现状及遗传演化情况。

1 材料与方法

1.1 病料采集和处理2017—2018年本实验室在河北省规模化养殖场共采集了278份疑似感染PEDV 的病猪临床样品，包括小肠及肠道内容物等。无菌采集肠道组织和肠道内容物于2 mL EP管中， 匀浆破碎后离心收集组织研磨液上清，冻存于-80℃ 保存备用。

1.2 细胞、毒株和载体Vero细胞由本实验室保存；PEDV阳性对照毒株(CV777，AJ1102株)由华中农业大学农业微生物国家重点实验室惠赠；CH-HB1-2018株由本实验室分离保存；DH5α感受态细胞、pMD18-T Easy Vector购自宝生物工程有限公司。

1.3 主要试剂DEPC购自美国Sigma-Aldrich公司；RNAiso Plus购自大连宝生物公司。Prime ScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa Ex Taq®，DL2000 DNA Marker和6×Loading Buffer购自大连宝生物公司；DNA纯化试剂盒和质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Alexa Fluor 488-conjugated 驴抗鼠IgG 购自Santa Cruz。

1.4 引物设计参考PEDV CV777，AJ1102株的S基因序列以及孙倩倩等[8]建立的区分PEDV经典毒株和变异毒株的RT-PCR检测方法，设计1个共用上游引物和2个分别针对经典毒株和变异 毒株的下游引物(表1)，用于PEDV流行病学调查。

表1 扩增目的片段引物

1.5 样品 RNA 提取及 RT-PCR按照试剂盒说明书提取总 RNA，按照 Prime Script Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书对 RNA 进行反转录，以得到的 cDNA 为模板，扩增目的片段，PCR 扩增程序为：95℃预 变性 5 min，95℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35个循环；72℃延伸 10 min。PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。

1.7 间接免疫荧光试验(IFA)将适量 PEDV 分别接种于 24 孔细胞培养板中长成单层 Vero 细胞，待 60%～70%的细胞产生 CPE 后收取细胞样品，PBS 洗涤 3 次，每次 5 min，室温下用 4%多聚甲醛固定 15 min，再用预冷的甲醇透化 10 min。PBS 洗涤 3 次，用含 5%BSA 封闭 30 min，每孔加入适当稀释的抗 N 蛋白单克隆抗体，37℃孵育 1 h，PBS 洗涤 3 次，每孔再加入二抗(Alexa Fluor 488-conjugated 驴抗鼠 IgG)，37℃避光作用 45 min，PBS 洗涤 3 次，置于倒置荧光显微镜下观察。

1.8 PEDV 全基因组扩增、克隆及序列测定参照 AJ1102 株序列，设计 PEDV 全长引物，见表 2。用该引物对分离毒株 CH-HB1-2018 进行全基因扩增，PCR 反应条件为：95℃，5 min；95℃，1 min；56℃，1 min；72℃，2 min， 35 个循环；72℃，10 min。PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定后，按照 DNA 胶回收试剂盒说明书对 PCR 产物进行回收纯化，并与 pMD18-T 载体连接，转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，挑取白色菌落摇菌，将鉴定阳性菌液送公司测序。

表2 PEDV 全基因组扩增引物

1.9 PEDV 全基因组序列比对和进化树分析利用 DNAstar 软件对测序结果进行序列比对分析，与 GenBank 中已上传的国内外 PEDV参考毒株全基因序列和 S 基因序列进行同源性比对和遗传进化分析，参考毒株信息见表 3。

表3 PEDV 参考毒株信息

2 结果

2.1 RT-PCR 检测方法验证按照本研究设计的 RT-PCR 检测方法分别对 CV777 经典株和 AJ1102 变异株进行验证， PCR 产物经由 1%琼脂糖凝胶电泳试验鉴定(图 1)，表明本研究设计的检测方法可以有效区分 PEDV 变异毒株和经典毒株。

图1 RT-PCR 检测方法验证结果 M.DL2000 DNA Marker；1.CV777 经典株；2.AJ1102 变异株；3.阴性对照

2.1 病料检测本研究在河北省多个地区规模化养殖场共采集 278 份病猪临床样品，各地区采样及病毒分离情况如图 2 所示，其中承德、张家口病毒分离率较低，保定、石家庄病毒分离率较高，表明病毒的流行情况可能与当地的生猪养殖密度有关。本研究设计的 RT-PCR 诊断方法可以特异性区分 PEDV 变异毒株和经典毒株(图 3)，利用该对引物对采集的 278 份病猪临床样品进行 PEDV 检测。

图3 PEDV 变异毒株 RT-PCR 鉴别诊断的扩增结果M.DL2000 DNA Marker；1：PEDV 样品；2.阴性对照；3.AJ1102 变异株阳性对照；4.CV777 经典株阳性对照

图2 2017—2018 年河北省各地区PEDV分离情况

2.2 PEDV 毒株的分离鉴定根据采样时间、地点等因素选取14份阳性样品进行病原分离，取处理好的组织研磨液上清感染 Vero 细胞，盲传 3 代后发现 3 号样品在第3代 Vero 接毒样品中出现明显 CPE， 收取病毒液后继续进行培养，最终获得 1 株能够在 Vero 细胞上稳定传代的 PEDV 毒株。利用PEDV N蛋白单抗作为一抗，通过 IFA 试验检测传代的 PEDV 在 Vero 细胞上的增殖情况(图 4A)，进而证实成功分离到 1 株 PEDV 毒株，将其命名为 CH-HB1-2018 株。

图4 PEDV 的间接免疫荧光检测 A.PEDV 株；B.PEDV 阴性对照；C.PEDV 阳性对照

2.3 PEDV分离毒株全基因组片段扩增、克隆及序列拼接通过 RT-PCR，优化扩增条件，成功扩增出 CH-HB1-2018 株全基因组 DNA 片段，各片段大小与预期相符，将全基因组各片段送公司进行测序，利用 DNAstar 软件对测序结果进行拼接后获得 CH-HB1-2018 株的全基因组序列，并提交至 GenBank，登录号为 MK606368。

2.4 PEDV全基因组序列进化树分析利用 MEGA6.0 软件绘制 CH-HB1-2018 株与 29 株国内外 PEDV 代表毒株全基因组的系统进化树(图 5)以分析其遗传进化关系。30 株 PEDV 序列主要形成 G1，G2，G3 共3个进化分支，G1 分支主要由 CV777，SM98 等经典毒株组成，G2 分支由 AJ1102，AH2012 等变异毒株组成，G3 分支主要包括 OH851，ZL29 等 SINDEL 毒株。本研究分离毒株CH-HB1-2018 属于 G2 分支，且与 AJ1102 毒株的遗传进化距离较近。

歌词一：清明的风/吹绿了你的胡同/梨花雨/淋湿了书生的梦/树叶儿落/头顶上秋雁呢哝/城门外/没贴你名字

图5 PEDV 全基因组序列系统进化树分析 ▲表示本研究分离毒株

2.5 PEDV 全基因组序列核苷酸同源性分析通过 MegAlign 软件对 CH-HB1-2018 株与国内外 29 株 PEDV 代表毒株进行全基因组序列核苷酸同源性比对(图6)。结果显示，CH-HB1-2018株与中国变异毒株AH2012株和美国变异毒株IA2株的同源性最高，均为99.0%，与AJ1102，LC株等变异毒株的同源性相对较高，在98.0%～99.0%之间，与经典毒株的同源性最低，在96.2%～97.5%之间。

图6 30株毒株全基因组核苷酸同源性比较

2.6 PEDV S基因序列进化树分析S基因在 PEDV 基因组中变异最为明显，对 CH-HB1-2018 株与 29 株代表株的 S 基因进行遗传演化分析，结果如图 7 所示。与全基因组序列进化树相同，30 株 PEDV 的 S 基因分 别形成以经典毒株、变异毒株和 SINDEL 毒株为代表的 G1,G2,G3 分支，CH-HB1-2018 株的 S 基因从属于 G2 分支，与 ZJCJ4 株和 AJ1102 株的遗传进化距离最近。

图7 S基因序列系统进化树分析 ▲表示本研究分离毒株

2.7 PEDV S 基因序列核苷酸同源性分析利用与全基因组序列比对的相同方法对 30 株 PEDV 毒株的 S 基因进行核苷酸同源性比对分析(图 8)。结果显示，CH-HB1-2018 株与经典毒株和 SINDEL 毒株 S 基因的同源性分别在 92.5%～94.2%和 94.9%～95.1%之间，与变异毒株 S 基因的同源性在 97.7%～98.9%之间， 其中与 ZJCZ4 株的同源性最高为 98.9%，与系统进化树分析结果一致。此外，30 株 PEDV 毒株 S 基因间的同源性显著低于全基因组序列的同源性，进而表明 S 基因变异最为明显。 核苷酸序列比对结果显示，CH-HB1-2018 株与经典毒株和 SINDEL 毒株相比在 162,170～180和 413～415 nt 处存在核苷酸插入，在 470～475 nt 处存在核苷酸缺失，与变异毒株的 插入缺失位点一致，表明本研究分离毒株为变异毒株。

图8 30 株毒株 S 基因核苷酸同源性比较

3 讨论

1984年我国在上海首次分离到PEDV，至今已在我国诸多省份广泛流行，给我国养猪业乃至公共卫生事业造成巨大的威胁[9]。2010年之后出现的PEDV变异毒株与早期经典毒株相比，呈现出致病性更强、流行范围更广等特点，因此，急需对PEDV的流行变异情况进行密切监测。本研究对2017—2018年间在河北地区采集的278份临床病料进行PEDV检测，阳性率为19.1%，其中PEDV变异毒株阳性率为17.6%，说明PEDV变异株的流行是当前引起猪流行性腹泻的主要原因。

PEDV只有1种血清型，但很多学者根据其全基因组、S基因或M基因将其分为不同分支以探究其遗传演化规律[10-14]。PARK等[15]根据部分S基因序列将其划分为G1,G2,G3分支；LEE等[16]根据S基因的全长序列将其划分为G1,G2两个分支；CHEN等[17]根据PEDV全基因组将其划分为G1,G2,G3共3个分支，其中G3群又被分成4个亚分支。本研究根据遗传演化分析结果将毒株分为了3个分支，分别为以CV777经典毒株为代表的G1分支,以IA2,AJ1102等变异毒株为代表的G2分支和以ZL29,OH851等SINDEL毒株为代表的G3分支。进化树分析结果显示，PEDV流行毒株的地域特点并不显著，在世界各地均有分布流行，本研究分离毒株CH-HB1-2018株为变异毒株，从属于G2分支，结合流行病学调查结果分析发现当前河北地区PEDV流行毒株以变异毒株为主，但也有经典毒株的存在。

SATO等[2]研究发现，DR13株的S基因在病毒传代过程中出现多个氨基酸位点的突变或缺失，并且PEDV的S基因存在29个潜在糖基化位点[18]，因此S基因被认为与病毒毒力相关。本研究对30株PEDV序列的S基因进行序列比对发现，CH-HB1-2018株存在与变异毒株相同的氨基酸插入、缺失位点，且同源性分析结果表明S基因的变异程度最大，由此推测S基因在 病毒遗传演化过程中可能起到重要作用。

本研究通过对病毒的分离鉴定、遗传演化分析和同源性比对发现河北省PEDV流行毒株与参考毒株间的同源性较低，提示我们PEDV流行毒株持续发生遗传演化，随之可能会产生新型变异毒株。此外，S基因的高度变异极有可能增强病毒毒力，致使病毒致病性增强， 对该病毒的防控及公共卫生安全都存在巨大的威胁，因此，应该对PEDV的流行变异情况进行及时且密切的监测。本研究为河北省的PEDV流行病学调查提供了一定的参考依据，对该病毒的防控及净化具有非常重要的现实意义。