马抗天花病毒免疫球蛋白的制备及免疫防护效果评价

闫 莉，李 敏，刘 媛，杨晓岚，谷宏婧，范铁炯，张志平，闫 芳*，赵忠鹏*

(1.山西省农业科学院 畜牧兽医研究所,山西 太原 030032；2.军事医学研究院 微生物流行病研究所感染免疫与防治研究室，北京 100071；3.山西农业大学 动物科技学院，山西 晋中030800； 4.上海赛伦生物技术股份有限公司，上海 201418)

天花是一种由天花病毒引起的烈性传染病。天花病毒不仅繁殖快，还能在空气中迅速传播，而且在感染后的15～20 d内致死率高达30%。自 1980 年WHO 宣布全球消灭天花后，疫苗停止使用，目前人类已失去针对天花的免疫力，天花病毒又可以成为重要的生物武器[1]。最近，美国、俄罗斯高等级实验室发生的生物安全事故，也时刻提醒我们必须做好充分的准备[2-3]。尽管有化学合成药物用于天花病人治疗，但不是特效药，且存在久用易引起耐药、肝损伤等关键问题[4]。面对猴痘病毒的现实威胁和天花病毒的可能威胁，美国最近又批准了一款非复制型天花疫苗，但也仅限于紧急情况下使用[5]。除通过疫苗接种进行预防以外，亟待研究一种特效的生物治疗药物，以从不同角度进行全面防护。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞痘苗病毒天坛株，是由中国疾病预防控制中心病毒病研究所提供，原是自 1926 年从天花患者的疱痂中分离出来的病毒，经连续传代减毒而获得。

鸡胚成纤维细胞，SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验技术有限公司。方法：取9～11日龄SPF鸡胚，无菌条件下取出鸡胚，去除内脏，用Eargl's液清洗3次，剪碎，加入用DMEM 培养液配制的0.25% 胰酶，37℃消化30 min，室温下静置，待组织块沉淀后，将上层胰蛋白酶液倒出，用吸管吹打3次，将组织块全部分散，吹打后上层细胞悬液合并，计数，加入细胞培养瓶中，并加入适量DMEM 培养液，37℃培养24～28 h，待细胞长满后使用。

Vero细胞，由军事医学研究院微生物流行病研究所细胞库提供。

1.2 实验动物健康马匹，3～5岁，10匹，经检疫符合现行《中国药典》要求。

BALB/c小鼠，6～8周龄，体质量18～20 g，购于斯贝福实验动物公司。

1.3 主要试剂及仪器细胞用培养基、血清、胰酶购自Gibco公司； ISA206佐剂购自法国SEPPIC公司；细胞用培养瓶、细胞工厂耗材购自Corning公司；区带离心机购自Beckman公司；ACTA Purifier 900纯化仪购自Amersham Biosciences公司；层析填料购自GE公司。

1.4 痘苗病毒天坛株的生产、纯化及检定鸡胚成纤维细胞长满后，接种痘苗病毒液，接种量为0.1 MOI，37℃培养96～120 h，在细胞全病变后24 h 内收获病毒。300 000 Millipore超滤膜包浓缩102倍；蔗糖区带30 000 r/min离心6 h,分段收集蛋白峰；利用Sepharose 4FF凝胶层析，收集病毒蛋白峰。透射电镜观察天坛痘苗株病毒形态；接种硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养进行无菌检定；用半流体和肉汤培养基检测支原体；接种小鼠、鸡胚和细胞，进行外源因子检查；进行HPLC检测纯度。

1.5 免疫用抗原制备及原料血浆的生产方案1是将纯化灭活病毒抗原与等体积的206佐剂混合，乳化，经马匹颌下、腹股沟淋巴结至少10点注射免疫，前4次基础免疫剂量分别为1,2,3,4 mg，每次间隔21 d，末次免疫后14 d，测定中和抗体效价。方案2是将纯化病毒抗原，经PBS调节浓度，经马匹颌下、腹股沟淋巴结至少10点注射免疫，前4次基础免疫剂量分别为5×107,6×107,7×107,8×107PFU病毒量，每次间隔21 d，末次免疫后14 d，测定中和抗体效价。2种方案的血清效价均不低于1∶3 200 时，采血，分离血清。

1.8 马抗天花病毒免疫球蛋白在动物体内的预防效果选用BALB/c小鼠20只，分5组，4只/组。用PBS稀释配制马抗天花病毒免疫球蛋白4个浓度，分别为5.2，2.6，1.3，0.65 g/L，每只小鼠静脉给药0.5 mL，6 d后静脉注射痘苗病毒1×106PFU，观察小鼠体质量变化及结痂、死亡情况。

1.9 马抗天花病毒免疫球蛋白在动物体内治疗效果选用 BALB/c小鼠20只，分5组，4只/组。每只小鼠静脉注射痘苗病毒天坛株1×106PFU，观察小鼠至身体发痘；再用PBS稀释配制马抗天花病毒免疫球蛋白4个稀释度，分别约为5.2,2.6,1.3,0.65 g/L，每只小鼠静脉注射0.5 mL治疗；用等量生理盐水做对照治疗。继续观察各组小鼠体质量、出痘及死亡情况。

2 结果

2.1 痘苗病毒天坛株的生产、纯化及鉴定透射电镜观察纯化病毒符合痘苗病毒形态(图1左),无菌、无支原体、无外源因子；用HPLC检测纯化的抗原纯度在90%以上(图1右)。结果表明，免疫用抗原符合现行《中国药典》的标准。

图1 痘苗病毒天坛株纯化抗原的检测结果 左.透射电镜结果；右.HPLC检测结果

图2 马抗天花病毒免疫球蛋白成品检定结果 左.成品SDS-PAGE代表性结果；右.成品HPLC代表性结果

表1 MTT测马抗天花病毒免疫球蛋白对痘苗病毒天坛株的中和效果

图3 马抗天花病毒免疫球蛋白成品预防实验小鼠平均体质量变化

图4 马抗天花病毒免疫球蛋白成品治疗小鼠平均体质量变化

3 讨论

天花是世界上传染性、致病性最强的疾病之一。由于天花病毒具有极大的传染性和杀伤性，而且各国相继停止接种牛痘疫苗，人类已失去对天花病毒的免疫保护，因此，天花病毒有成为极端势力的有力生物武器。目前，世界上还有两处保存天花病毒的场所，位于亚特兰大的美国疾病预防与控制中心和俄罗斯国家病毒学和生物技术研究中心，近些年，这些保存中心时常发生安全事故，加剧了各国对生物安全的担忧[6]。

尽管有化学合成药物西多福韦用于天花病人治疗，但疗效有限，且副作用很强，至今还没有特效药。鉴于目前的生物安全情况，美国2019年批准了一款非复制型天花疫苗，以备不测。而我国大多数人群没有对天花的免疫力，随着我国海外利益的增多和对外交往的不断扩大，天花病毒或类似的猴痘病毒成为最为现实的生物安全威胁[7]，由此研究天花特效药成为当今迫切而又重大的社会需求。

鉴于人类历史与传染病斗争的经验，最有效而经济的手段之一是抗血清的被动免疫治疗，在某些重要传染病的治疗和预防上至今仍被使用，发挥无可替代的重要作用。

治疗性抗体研发最核心最关键的环节是免疫抗原的选择和制备。痘苗病毒天坛株是自1926 年从天花患者的疱痂中分离出来的病毒，经连续传代减毒而获得。痘苗病毒天坛株的使用，使中国清除了天花，表明，对天花病毒有免疫保护效果；同时，由于同猴痘病毒的亲缘关系很近，有可能对猴痘病毒有一定的免疫保护效果。痘苗病毒天坛株的大规模培养、纯化及检定技术非常成熟，我们选择鸡胚成纤维细胞培养天花病毒，经密度梯度离心和层析纯化，制备出合格的抗原，其纯度达80%以上，形态符合天花病毒特征，达到了现行《中国药典》对免疫用抗原的要求。

健康马匹的免疫方案，我们选择了活病毒免疫或灭活疫苗加佐剂免疫两套方案，虽然都能达到最终免疫效果，但考虑到活病毒的生物安全顾虑、成本高等因素，最终选择灭活疫苗加佐剂方案。

对天花病毒等烈性病原体防治产品开发的瓶颈是依赖高等级生物安全实验室和无天花病毒、猴痘病毒两个病原体。借助痘苗病毒天坛株，我们建立了细胞感染模型和动物感染模型2种方法，突破了该瓶颈。虽然2个模型，不能完全替代用天花病毒或猴痘病毒建立的模型，但考虑到其保护采用同样的免疫保护机理，可以作为重要而有益的参考[9]。