呕吐毒素脱毒菌对生长猪小肠内Hsp70分布和表达的影响

董永芳，王金全，陈红菊,杨婉莹，黄丽波*，王春阳*

(1.山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271018；2.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081)

呕吐毒素(deoxynivalenol，DON)是禾谷镰刀菌和黄色镰刀杆菌等真菌产生的单端孢烯族类毒素，广泛存在于粮谷类作物及饲料中。因此谷物及农产品一旦被污染DON，则营养价值受到损失严重，并造成农业经济严重的损失[1]。现已证实长期食用被DON污染的农产品能对动物机体产生免疫毒性[2]，影响机体代谢等毒性作用[3-5]，饲料中含有一定量DON可降低猪的生产性能，并使细胞的紧密连结蛋白表达减少[6-7]。目前对污染的饲料可采取的脱毒策略有物理脱毒法、化学脱毒法和生物脱毒法，但DON的分子结构特点决定了最有效的脱毒法为生物脱毒法，目前在市场上可以大规模应用的DON脱毒剂鲜少，因此寻找一种有效的脱毒剂至关重要。

Hsp70(heat shock protein 70，Hsp70)在多数生物体内均有表达，而且大多数细胞都能合成[8]。已证实其有分子伴侣功能，提高细胞对应激原的耐受性、抗细胞凋亡、减轻细胞过氧化及炎症性损伤等作用[9-11]。本课题组的前期研究证实日粮添加ZEN 引起断奶仔猪小肠 Hsp70 表达异常[12]，本试验是在已有的研究基础上，通过对生长猪的饲养试验，验证DON脱毒菌对DON的脱毒效果，探讨脱毒菌对DON致猪小肠内 Hsp70 分布和蛋白表达量的影响，为进一步阐明DON脱毒菌在预防DON对猪消化机能的危害提供了试验依据。

1 材料与方法

1.1 日粮镰刀菌毒素含量的测定基础日粮参考美国NRC (2012)营养标准并根据实际生产配制。试验所需日粮于试验正式开始前7 d一次性配制完成。在试验开始和结束后分别取样，用以分析饲粮中的镰刀菌毒素含量。 ZEN(玉米赤霉烯酮)、AFB1(黄曲霉毒素)、DON和 FB1(伏马菌素)含量采用LC-MC检测方法检测，由中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所完成。

表1 镰刀菌毒素含量检测结果 μg/kg

1.2 脱毒菌sp.WJ106脱毒菌：中国农业科学院饲料研究所王金全提供[13]。

1.3 试验动物分组、饲养管理及生长性能指标的测定试验采用单因子试验设计，选取4月龄日龄体质量为(55.58±1.83) kg的健康PIC父母代生长猪24头，随机分为3组，每组8个重复，每个重复1头猪，组间初始体质量差异不显著(P>0.05)。对照组：饲喂基础饲粮； DON组：饲喂添加5 000 μg/kg的DON日粮(实测DON含量为5 429 μg/kg)。DON+脱毒菌组：饲喂在DON组日粮的基础上添加脱毒菌15 mL/kg的日粮。

预试期7 d，正试期28 d。试验期间单笼饲养，自由采食和饮水，饲养和免疫按常规程序进行。

试验期间每天记录试验猪的采食量和剩料量，并根据以上数据计算平均日增质量(ADG) 、平均日采食量(ADFI) 和料质量比〔F/G，日增质量(g)/采食量(g)〕。

1.4 样品采集试验结束后，将生长猪电击、放血致死。打开腹腔，快速取十二指肠、空肠和回肠组织(取材位置尽量一致)，1份置于Bouin's液中固定，用于观察分析Hsp70 阳性物质分布规律；1份-80℃ 保存，用于Western blot分析。

1.5 免疫组化(超敏二步法)将石蜡切片(片厚5μm)贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上，经过脱蜡、脱苯至蒸馏水，柠檬酸缓冲液(pH 6.0)热修复、3% H2O2封闭内源性过氧化物酶、10% 犊牛血清封闭后进行Hsp70的免疫组化染色。一抗为兔抗鼠Hsp70多克隆抗体(1∶100，北京博奥森生物技术有限公司)，4℃过夜；二抗为Polink-2 plus®超敏二步法免疫组化检测试剂盒(PV-9001，北京中杉金桥生物技术有限公司)，DAB 显色(PA110，TIANGEN)，苏木精复染，脱水、透明、封片后，在显微镜下观察免疫阳性细胞分布规律并拍照(阳性产物呈棕黄色)。阴性对照的一抗用PBS代替，其他步骤相同。

1.6 Hsp70的Western blot分析取50～70 mg 冻存小肠组织，液氮研磨，提取总蛋白质，并用BCA法测其浓度。上样体积20μL；蛋白含量40 μg；电泳分离蛋白、转膜，5% 脱脂奶粉室温封闭2 h；一抗(兔抗 Hsp70多克隆抗体，1∶200，北京博奥森生物技术有限公司；抗β-actin小鼠单克隆抗体，1∶300，碧云天生物技术有限公司)，4℃ 孵育过夜，TBST 洗3次；二抗(山羊抗小鼠IgG，1∶2 000，CW0102S；山羊抗兔IgG，1∶2 000，CW0103S，康为世纪)，4℃孵育2 h，TBST 洗3次； ECL显色(BeyoECL Plus P0081，碧云天生物技术有限公司)，Fusion FX7高端多功能成像系统(北京五洲东方科技发展有限公司)拍照。

2 结果

2.1 生产性能检测结果DON对生长猪生长性能的试验结果(表2)显示日粮中添加DON引起猪的ADG明显下降(P<0.05 )， F/G显著升高了(P<0.05)，与对照组相比差异显著(P<0.05)。在加入脱毒菌之后(表2)，DON+脱毒菌组猪的ADG有所升高，F/G、ADFI降低，接近对照组水平。试验过程中观察到DON组的猪只在第1周阶段的采食量有所下降，随后猪的采食量又逐渐增加，并且高于对照组。

表2 DON对生长猪生产性能的影响

2.2 小肠中Hsp70的分布观察结果免疫组织化学结果显示：十二指肠(图1)、空肠(图2)和回肠(图3)均有Hsp70阳性反应物分布，Hsp70阳性反应物主要分布在小肠绒毛黏膜上皮细胞、小肠腺上皮细胞内，阳性反应物颜色呈棕黄色、黄色，阴性对照不着色。DON组的阳性反应明显强于对照组。DON组的3个肠段的Hsp70的表达量均提高，其中十二指肠的Hsp70阳性表达量最高，包括小肠绒毛以及小肠腺体均呈强阳性反应，颜色为棕黄色或棕色，空肠段在绒毛上皮的顶端有强阳性反应物分布，颜色为棕黄色，但弱于十二指肠和回肠，回肠段绒毛上皮及小肠腺上皮细胞的阳性反应均呈强阳性。加入脱毒菌之后，小肠绒毛的阳性反应强度较DON组弱，十二指肠绒毛上皮的阳性反应减弱明显，但仍高于对照组，空肠的阳性反应减弱不明显，明显强于对照组，而回肠段在绒毛上皮也可见阳性反应减弱明显，但仍强于对照组。

图3 回肠内 Hsp70的免疫组化结果及蛋白的相对表达量(a,d,g.100 μm；b,c,e,f,h,i.20 μm) 箭头指示Hsp70的免疫阳性反应物质;iv.肠绒毛；ig.小肠腺；ie.肠绒毛上皮。a～c.对照组；d～f.DON组;g～i.脱毒菌组

图2 空肠内 Hsp70的免疫组化结果及蛋白的相对表达量(a,d,g.100 μm；b,c,e,f,h,i.20 μm) 箭头指示Hsp70的免疫阳性反应物质;iv.肠绒毛；ig.小肠腺；ie.肠绒毛上皮。a～c.对照组；d～f.DON组;g～i.脱毒菌组

图1 十二指肠内 Hsp70的免疫组化结果及蛋白的相对表达量(a,d,g.100 μm；b,c,e,f,h,i.20 μm) 箭头指示Hsp70的免疫阳性反应物质;iv.肠绒毛；ig.小肠腺；ie.肠绒毛上皮。a～c.对照组；d～f.DON组;g～i.脱毒菌组

2.3 Hsp70的Western blot分析结果结果表明，生长猪小肠各段均有Hsp70蛋白表达(图4)，DON组以十二指肠Hsp70蛋白相对表达量最高(P<0.05)，回肠次之，空肠最低，添加脱毒菌后，十二指肠和回肠的蛋白表达量明显较DON组降低，趋于对照组水平，其中十二指肠最为显著(P<0.05)，空肠的蛋白表达量降低不明显，略高于对照组水平，无显著性差异(P>0.05)。

3 讨论

3.1 DON脱毒菌对生长猪生产性能的影响猪对DON最敏感。研究显示DON能够破坏肠道的黏膜免疫，打破肠内稳态，增加了机体的易感性[14]。DON 经口服后可以穿过机体小肠屏障被迅速吸收，进入血液循环并分布至外周各器官，FROBOSE等[15]对育肥猪饲喂含有4 mg/kg DON的日粮试验结果显示育肥猪的ADG与ADFI显著降低；断奶仔猪试验结果发现1.5，3.0 mg/kg2个剂量的DON会使ADG和ADFI随着DON剂量的增加呈剂量依赖性的降低。本试验对生长猪的试验结果同样出现ADG明显减少、体质量减轻的情形。与已有的研究证实DON引起生产性能下降的现象相吻合[2,4-5,15]，分析主要因素是DON对猪小肠粘膜层的损坏，主要是绒毛损伤和上皮脱落，直接影响了肠黏膜上皮对营养物质的吸收[7,16]。SUSAN-NEDÖLL等[17]在探究DON对易感动物的影响时发现DON的强大的饲料抑制作用，在许多情况下，由DON导致猪采食量下降引起的能量和营养摄入减少的危害比DON的毒性作用本身更为明显。而本试验中添加脱毒菌之后在一定程度上提高了生长猪的生产性能，推测是脱毒菌减轻了DON对肠道结构的损伤，提高了营养摄入的缘由。

3.2 DON脱毒菌对 小肠Hsp 70表达的影响Hsp70是一种高度保守的内源性的保护蛋白，在防止聚集和协助非天然蛋白的折叠方面具有重要的作用，在正常细胞中水平普遍较低，在应激状态下可显著升高。Hsp70的高表达也是机体受到应激的信号标志，可能在保护肠黏膜免受细胞毒性物质侵害和细胞应激的影响方面发挥重要作用。TONOMURA等[20]认为谷氨酰胺对软骨细胞的保护作用，使细胞免受热应激诱导的凋亡可能是由Hsp70介导的。Hsp70在仔猪的表达的试验显示，断奶后胃和十二指肠中Hsp70的表达短暂增加，而回肠中Hsp70的表达短暂减少[21]，提示同一应激条件下Hsp70在小肠3段内的表达存在差异。OTAKA等[22]试验研究证明，Hsp70的过度表达可以阻止各种损伤因素引起的大肠黏膜炎症过程的发生，在冰醋酸引起的小鼠结肠黏膜炎症反应模型中Hsp70是高水平表达。

完整的肠道的黏膜结构是可以防止摄入饲料污染物的主要屏障，也是防止肠道感染的第一道防线，它有效防止肠道内细菌和内毒素等有害物质通过肠黏膜进入体内，正常的肠道黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障共同组成[18]，其中机械屏障的基础结构是相邻肠上皮细胞之间的紧密连接蛋白[6-7,23]。

而氧化应激是恰恰是DON 造成机体损伤的另一种已知机制，产生大量自由基消耗体内抗氧化剂[23,24]。在本试验结果中显示，3个肠段的Hsp70的表达量均提高，其中十二指肠的Hsp70阳性表达量最高，包括小肠绒毛以及小肠腺体均呈强阳性反应，笔者分析认为在十二指肠，是食糜最先接触的肠道，DON含量在3个肠段中最高，所以当DON损伤了小肠黏膜上皮细胞之间的紧密连接蛋白时，破坏了小肠黏膜的机械屏障、化学屏障和生物屏障，导致了胰液和胆汁对小肠的继发损伤，因此激发了十二指肠黏膜的Hsp70的高表达。SERGENT等[25]研究发现，摄入的 DON大部分都在小肠的十二指肠和空肠经过细胞旁路被吸收进血液。本试验回肠段的阳性反应强于空肠但弱于十二指肠，与DAVID等[21]对仔猪断奶应激引起小肠的Hsp70的表达相反，我们认为可能原因是在回肠段DON浓度降低，但少量的DON会刺激回肠固有层弥散淋巴组织发生局部免疫反应，进而引起了Hsp70的高表达，同时也提示Hsp70的表达与应激因素密切相关。

脱毒剂是通过改善饲料的品质，为动物及人类健康提供额外保障。目前对FB1、ZEA的处理效果均比较成熟，但DON的脱毒剂产品目前市场上仅有百奥明公司独享专利成果，因此针对DON脱毒剂产品的研发也成为热点。付苗苗等[26]发现绿脓杆菌接种于毒素提取液中72 h后呕吐毒素浓度可降低至50.0%。也有研究证实酿酒酵母能与DON结合[27]，LI等[13]证实了本次试验使用的DON脱毒菌对自然霉变小麦产生的DON具有良好的脱毒效果。本试验在加入脱毒菌之后，其3段肠绒毛上皮的阳性反应皆有所减弱，趋于对照组水平，依据已有的试验结论，根据该结果推测，一种因素是脱毒菌降解了部分DON，减少了肠道对DON的吸收，另一种原因可能是脱毒菌与肠道菌群一起对肠道起到了保护作用，在一定程度上缓解了DON对肠道的侵害，进而改善了Hsp70蛋白的异常表达。

综上所述，脱毒菌对于DON造成的生长猪生产性能下降和小肠Hsp70蛋白的异常表达得到正向调节。

(感谢山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室和山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心为本试验提供的技术平)