乐孕宁口服液对妊娠缺血性贫血大鼠的作用机制研究

李柳柳 李晓红 常爱冰 杨宁娟 闫亚峰 符 敏 张海燕 吴 博 颜永刚* 朱丽红*

1.陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西 咸阳 712083； 2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000

乐孕宁口服液是遵照中医补气养血的治则，在《景岳全书·妇人规》胎元饮基础上，由多名妇产科专家基于长期临床实践经验总结的保胎验方，组方中含黄芪、党参、白术、续断、杜仲、白芍、补骨脂、当归、山药、大枣、砂仁等十一味药材，对妊娠恶阻、先兆性流产和复发性流产等具有良好的效果[1-2]。其中黄芪、党参和白术为君药，共奏补中益气、健脾养血之功，以达到气行血行、胎养安合之目的；续断、补骨脂和杜仲为疏通气血筋骨之要药，具补而不滞、行而不泄的特点，三者共为方中臣药，能补肝肾、益冲任；佐以当归补血理气，山药健脾固肾，达到调理血脉，补肾安胎的目的[3]。药理研究表明，乐孕宁口服液组方中多种活性物质可影响机体的造血功能，在一定程度上可成为治疗贫血的物质基础。如黄芪和当归多糖可促进造血干细胞的增殖、分化，刺激红细胞的生成[4]，党参皂苷可刺激骨髓造血细胞分裂[5]，大枣提取物可明显升高IDA大鼠血清铁含量、铁饱和度及肝脏铁含量, 并明显降低血清未饱和铁结合力[6]。

红细胞(RBC)是血液中数量最多的一种血细胞，与RBC相关的参数，如平均红细胞体积(MCV)，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)，红细胞体积分布宽度(RDW)等是临床上评估贫血严重程度和鉴别贫血类别的常用指标[7-8]。血红蛋白是红细胞内运输氧的特殊蛋白质，是反映贫血程度的重要指标[9]。在血红蛋白合成过程中，幼红细胞中的原卟啉(FEP)通过酶促反应与铁结合，如果机体缺铁，原卟啉将以高于正常水平的游离形式积聚[10]。血清与组织中铁的含量是铁储存量的重要评估指标，血清铁蛋白是人体铁元素的主要贮存形式，其水平反映了铁的结合能力[11]。转铁蛋白受体1(TfR1)和转铁蛋白受体2(TfR2)是与铁代谢相关的蛋白，负责铁的转运和利用。当机体处于缺铁状态时，转铁蛋白受体可为幼红细胞摄取铁元素提供条件，其表达会明显增强，一旦铁元素恢复正常水平，血清转铁蛋白受体就会随之降低[12-13]。本实验采用低铁饲料干预联合定期尾部放血法构建缺铁性贫血(Iron Deficiency Anemia, IDA)妊娠ID模型[14]，通过测定大鼠不同阶段血液和生化指标，系统评价乐孕宁口服液对妊娠IDA大鼠状况的改善作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 乐孕宁口服液(批号：20180305，陕西关爱制药有限公司)；琥珀酸亚铁片(规格: 0.3 g /片，批号: 2018130524，北京双鹤药业)。所用的清洁级低铁饲料和标准饲料均由南通特洛菲科技饲料科技有限公司提供。

1.1.2 动物 SPF级健康雌性Wistar大鼠，体重(160±15)g。SPF级健康Wistar雄性大鼠45只，体重(230±10)g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物审批许可号：SCXK- (川) 2018-30。研究所涉及的实验过程均按照动物护理指南进行，并获得动物伦理委员会的批准。大鼠分笼饲养于温度为(22±2)℃，湿度为45% 的空调动物房内。自由进食和饮水，并始终保持12h明暗交替，常规适应性饲养1周。

1.2 方法

1.2.1 妊娠IDA模型的建立 参考李美荃等[14]的造模方法并稍加改进，选取健康雌性Wistar 大鼠110只，常规性饲养1周。其中85只大鼠给予低铁饲料和去离子水，并定期尾部放血(每只大鼠2次/周，放血量1～1.5 mL只/次)。实验过程中采用不锈钢笼具和食盒，其余15只常规标准饲养为对照组。饲养4周后，各大鼠内眦静脉采血，EDTA抗凝后测定Hb含量。IDA大鼠以Hb ≤ 100 g/L为筛选条件进行后续试验，符合条件的为81只。将对照组大鼠和81只IDA雌性大鼠和筛选出的雌性大鼠与健康成年Wistar 雄鼠按照2: 1同笼交配，次日以雌鼠阴道冲洗物做阴道图片，在低倍镜下以见到精子计算妊娠期(孕0 d)。最终IDA模型大鼠成功受孕大鼠72只，对照组大鼠14只成功受孕。造模期间饲养条件保持不变。

1.2.2 动物分组及给药 将受孕成功的72只IDA大鼠按照血红蛋白水平随机分为6组，每组12只。各分组分别为：模型组(Model)，琥珀酸亚铁组(HPS)、乐孕宁高(LH)、乐孕宁中(LM)、乐孕宁低剂量(LL)和乐孕宁+琥珀酸亚铁组(LL+HPS)。对照组常规受孕作为Control组。HPS组按照(2 mg /kg)给予琥珀酸亚铁 ，LL、LM、LH组给予乐孕宁口服液相应剂量为1.5 mL /kg、3 mL /kg 、6 mL /kg，LL+HPS组按照(1.5 mL /kg+2 mg /kg)给药，各组均按 10 mL /kg 灌胃容积给药。Control组和Model组分别给予相同容积纯净水和去离子水，连续灌胃4周。

1.2.3 脏器指数的测定 大鼠用10% 水合氯醛麻醉后，腹主动脉采血，分离心脏和肝脏，冲洗干净并称重，于-80℃冷冻保存。

1.2.4 血液参数检测 分别于低铁饲料干预前，干预4周后，给药2周后和给药4周后眼眶取血约1～1.5 mL，EDTA抗凝后，用全自动血液分析仪测定血液中Hb、RBC、Hct、MCV、RDW等指标。

1.2.5 血液中游离原卟啉(FEP)的检测 末次给药后，水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，将血样保存于抗凝管中。取血适量滴于滤纸干燥，加入2% 硅藻土溶液适量洗脱过夜，加乙酸乙脂和冰乙酸(4∶1) 混合液，离心15 min，取上清加4 mL 0.5 NHCl振荡离心，荧光分光光度计法测定红细胞内游离原卟啉含量[15]。

1.2.6 血清和组织中铁含量的测定

1.2.6.1 血清制备 大鼠腹主动脉采血，7℃ 孵育30 min，3500 r/min离心10min，取上清，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.6.2 组织匀浆的制备 取适量心肌和肝脏组织适量，加入适量生理盐水，于匀浆机中匀浆，离心取上清，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.7 血清中铁蛋白(Fn)含量测定 取“1.2.6.1项下”血清适量，按照铁蛋白测定试剂盒测定血清中Fn的含量。

1.2.8 免疫组化法测定TfR1和TfR2 取心肌组织适量，按照试剂盒进行操作，Olympus BX50采集封片后的图像，并运用image pro plus 6.0软件对所得照片进行分析。

2 结果与讨论

2.1 各分组大鼠一般状况观察和体重称定结果 Control组大鼠行为和体态未见明显改变或异常现象。常规适应性饲养后所有大鼠均反应灵敏，活动正常，皮毛柔顺。低铁饲料喂养第9天，个别大鼠出现脱毛现象。2周后，大鼠脱毛现象已普遍出现，耳缘和脚爪出现较轻泛白，3只表现出神情倦怠。4周后，饲喂低铁饲料和去离子水的大鼠均出现不同程度皮毛脱落现象，每只大鼠耳缘和脚爪颜色苍白，神情倦怠，怕冷，多蜷缩成团状。

灌胃给药2周后，除Model组外，大鼠毛发脱落现象均有一定改善，各给药组大鼠食欲有所增加。给药4周后，Model组毛发出现片状脱落，各给药组体态和行为学已接近正常，除乐孕宁低剂量组大鼠尾部尚有些许泛白，其余组皆与Control组无明显区别。

各分组大鼠体重变化由图1(A)可知，大鼠体重在第1个测试点(即常规适应性饲养1周后)差异无统计学意义，且各分组体重大小均集中在170g左右，表明初始大鼠体重基本一致。由第1个测试点至第2个测试点为按照相应饲养条件喂养4周后大鼠体重变化，可看出Control组体重增长比其余各组速度快，结合图1(B)可知，Control组与其余各组体重之间有显著性差异(**P<0.01)，表明长期服用低铁饲料和去离子水会影响大鼠体重的正常增长。由第2个测试点至第3个测试点为灌胃给药2周后大鼠体重变化。各组体重增长速度由大至小依次为：Control组 > LH、HPS >其余给药组>Model组，表明不同给药组可不同程度减轻缺血性贫血所导致的体重增长缓慢状况，长期缺铁可能会影响妊娠期胎儿体重的正常发育。由第3个至第4个测试点为大鼠灌胃2周至第4周过程中体重的增长情况。Control组增长速度依旧最快。给药组LH和LL+HPS增长速度较之前也有所加快。表明这两个给药组相较于其它给药组改善缺铁性贫血引起的体重胎儿发育迟缓能力较强。

由图1(C)可知，长期低铁饲料喂养会导致妊娠大鼠体重持续增长迟缓，连续2周灌胃给药，Control组与其余各组体重之间有显著性差异(**P<0.01)。HPS、LL和LM给药组与Model组无统计学差异，LH和LL+HPS组与Model组有显著性差异(P<0.01)，表明乐孕宁高剂量和乐孕宁联合补铁剂可有效改善妊娠期胎儿发育迟缓情况。由图1(D)可知，灌胃给药4周后，HPS、LM、LH和LL+HPS组体重均与Model组有统计学差异，表明妊娠伴随缺铁性贫血可通过服用乐孕宁口服液可不同程度改善缺铁引起的不良后果。若联合补铁剂益气使用效果更佳。

2.2 乐孕宁口服液对大鼠心肌指数和肝脏指数的影响 由图2可知，与Control组相比较，Model组的心肌指数显著上升，差异有统计学差异；各个给药组与Control组相比较，指数有不同程度的上升趋势，但差异无统计学意义。各个分组间肝脏指数无统计学差异，但Model组和各个给药组肝脏指数均较Contro组有所升高。

注：A.心肌指数；B.肝脏指数图2 各分组大鼠心肌和肝脏指数测定结果

2.3 乐孕宁对血液各项指标的影响

2.3.1 不同时间点Hb含量水平

组别造模前合笼前给药2周后给药4周后Control137.21±5.98136.97±2.67134.3 ± 11.32129.37±6.53Model139.2±4.3188.63±3.62∗∗88.56 ± 7.4∗∗79.21±5.37∗∗HPS135.99±6.2784.96±1.80∗∗98.31±6.52∗∗ ##106.38±10.11∗ ##LL147.36±3.6587.69±2.18∗∗88.39±4.51∗∗91.26±6.28∗∗LM129.87±9.8185.36 ± 2.66∗∗92.78 ±3.4∗∗110.54±5.22∗∗ ##

表1 乐孕宁口服液对大鼠Hb的影响

由图3可知，Control组大鼠血液中Hb含量始终未有大范围波动，各个测定时间点间无统计学差异，提示体内铁含量一直在正常范围内。在第1个测定点时，即各组大鼠未做任何处理前，Hb含量均在正常范围内，彼此之间没有统计学差异。第2个测定点时，Control组和其余组Hb含量有显著性差异，Model组与给药组间Hb含量无统计学差异，表明低铁饲料饲养联合定期尾部放血4周后，大鼠体内Hb含量下降显著。各分组大鼠给药两周后，血液中Hb有不同程度的上升趋势，由表2得知，模型组与HPS、LH和LL+HPS组有显著性差异，表明此3个给药水平连续给药2周对于妊娠IDA有一定程度改善作用，LL和LM相对改善能力较小。给药4周后，Model组大鼠Hb水平与HPS、LM、LH和LL+HPS给药组有显著性差异，各组体内Hb水平有一定程度的升高，其中，HPS、LM、LH和LL+HPS组升高效果较为明显，Hb 水平>100 g/L。

图3 不同时间点各组大鼠血红蛋白含量图

2.3.2 对大鼠RBC、HCT、MCV、RDW的影响

由图4可知，连续给药4周后(第4个测定点)，与Control组相比较，Model组大鼠血中RBC、Hct、MCV明显降低，RDW水平显著升高，且差异有统计学意义(P<0.01)；与Model组相比较，HPS组及乐孕宁不同剂量组大鼠血RBC、Hct、MCV均明显升高，RDW水平显著降低，差异均有统计学差异(P<0.05)，表明长时间食用低铁食物会导血液中一些指标逐渐偏离正常状态。连续给药4周后，各项指标在一定程度上均有改善，表明乐孕宁不同剂量和HPS对于妊娠IDA具有一定的改善作用。其中，LH和LL+HPS这两个给药组效果较为明显，表明长期服用乐孕宁口服液可改善妊娠IDA引起的一系列症状，与HPS联合使用效果更为显著。

图4 乐孕宁口服液对大鼠血液RBC、HCT、MCV、RDW的影响

2.4 乐孕宁口服液对血液FEP的影响 由图5可知，与Control组相比，Model组大鼠血中FEP含量显著上升，差异具有高度统计学意义(P<0.01)。与Model组相比，各给药组血中FEP含量显著下降，差异均有统计学意义。其中，LH和LL+HPS组与空白相比无统计学差异，表明这两个给药组效果更为明显，这也与之前测定指标相一致。测定结果表明乐孕宁口服液可显著降低血液中游离FEP数量，进而改善妊娠铁缺乏。

图5 乐孕宁口服液对血中FEP含量的影响

2.5 乐孕宁口服液对血清和组织中的铁含量的测定

2.5.1 血清中铁的含量 由图6可知，与Control组相比，Model组大鼠血清中铁的含量显著降低，差异有显著性，这表明缺铁组大鼠体内的铁含量会低于正常对照组；与Model组相比，各给药组血清中铁的含量均有一定程度的升高，且有显著性差异。这表明乐孕宁口服液可有效增加血液中铁的含量，促进铁吸收。

图6 各分组中血清铁的含量

注：A.心肌；B.肝脏图7 心肌和肝脏中铁的含量

2.5.2 组织中铁的铁含量 由图7可知，与Control组相比，Model组大鼠心肌和肝脏中铁的含量显著降低，且降低程度有显著性差异；各给药组与Model组相比，心肌和肝脏中铁的含量有一定的上升趋势，其中LM组心肌铁含量与Model组相比升高趋势有统计学意义。LH和LL+HPS组较模型组升高有显著性差异，与空白对照组比差异无统计学意义；肝脏中铁含量的测定结果中，LH和LL+HPS组相较于Model组铁含量升高有统计学差异，提示乐孕宁高剂量和乐孕宁联合琥珀酸亚铁组有较好地提高肝脏组织中铁含量的效果。组织和血液中铁含量测定结果表明，乐孕宁口服液可有效升高血液和组织中铁含量，且在一定范围内呈现出剂量依赖性。

2.6 铁蛋白含量测定 由图8可知，与空白组相比，模型组血清中Fn含量显著降低(P<0.05)；与模型组学相比，各给药组血清中Fn含量均不同程度上升，其中，HPS、LM、LH和LL+HPS组与模型组相比均有显著性差异。LH和LL+HPS组血清中Fn含量与空白组无统计学差异，表明连续给药4周，乐孕宁口服液和乐孕宁联合琥珀酸亚铁对于妊娠IDA效果极好。

图8 各分组中Fn的含量测定结果

2.7 心肌中TfR1和TfR2的测定 免疫组化结果显示，TfR1和TfR2在各个分组中的表达有一定的差异。由图10所示，与Control组相比，Model组的TfR1和TfR2表达量显著下降，差异有显著性意义。与Model组相比，各给药组TfR1和TfR2表达量有不同程度的上升。其中，HPS组、LH组和LL+HPS下降量与Model组相比有统计学差异。表明乐孕宁口服液可升高妊娠IDA大鼠体内TfR1和TfR2水平。

注：A、B、C、D、E、F、G分别对应的组别为:Control、Model、HPS、LL、LM、LH、LL+HPS给药组。图9 乐孕宁口服液对心肌组织中TfR1表达的影响

注：A.TfR1；B.TfR2图10 心肌中TfR1、TfR2的表达

3 讨论

妊娠合并轻、中度贫血是临床常见的疾病，长期铁缺乏会影响子代体重和神经系统的发育[15-16]。目前治疗妊娠IDA的主要思路是及时补充铁剂和去除引发IDA的诱因，临床上主要采用口服亚铁盐与食疗相结合的方式来改善缺铁状况。研究证明，该方式具有一定疗效，但口服亚铁盐往往存在胃肠道反应重，吸收不理想等缺点[17-18]。 IDA在中医属于“血虚”“脾虚”范畴，是因脾运失健而致气血生化不足产生的疾病，临床表现属气血两虚证。临床表明，补铁剂与部分中成药联合在改善缺铁性贫血方面具有很好的疗效，不仅可增加机体自身的造血功能，还可有效降低胃肠道的不良反应[9-10,19]。乐孕宁口服液作为妇科临床常用品种之一，方中所含的当归、白芍和山药合用可有效补血养血，各味药材彼此之间相互作用，共奏健脾益气、滋阴养血，调理血脉，补肾安胎之功效[3]。

在IDA临床诊断过程中，血常规、Hb含量、FEP含量、铁蛋白含量等指标对于评价缺血程度具有重要意义[20]。本研究基于上述指标，系统评价乐孕宁口服液对于妊娠IDA状况的改善作用，并对其改善机制进行了初步探究。研究结果表明，按照一定疗程服用乐孕宁口服液后可改善妊娠IDA缺铁状况，但单用效果并不明显，若与补铁剂合用效果更佳。其对于妊娠IDA改善作用主要表现为可显著升高RBC、Hct、MCV水平，降低RDW水平。此外，乐孕宁口服液还可有效升高妊娠IDA大鼠组织所含铁水平、降低血清中FEP含量，免疫组化结果显示，乐孕宁口服液高剂量组和乐孕宁联合琥珀酸亚铁组在一定程度上可促进心肌组织中TfR1和TfR2的表达。这表明，乐孕宁口服液改善缺铁状况的机制之一有可能是通过促进TfR1和TfR2的表达，进而影响机体铁代谢来维护妊娠期妇女体内铁的正常水平。

乐孕宁口服液作为保胎品种之一，被广泛应用于临床实践中，显示出了良好的治疗效果。本研究表明，乐孕宁口服液对妊娠IDA具有明显的改善作用，可作为治疗临床妊娠IDA的潜在药物，但单用效果不如与补铁剂合用明显，建议与补铁剂联合使用。本研究对乐孕宁口服液更好地服务于临床实践提供了一定的参考，有利于乐孕宁口服液在临床适应症上的进一步扩展。