地黄饮子HPLC指纹图谱研究

郭司群 迟晓雪

1.呼伦贝尔市食品药品检验所，内蒙古 呼伦贝尔 021008；2.呼伦贝尔市草原工作站，内蒙古 呼伦贝尔 021008

地黄饮子出自《黄帝素问宣明论方》，主治瘖痱证，症见舌强不能言，足废不能用，口干不欲饮，苔黄腻，脉沉、细弱。地黄饮子是传统的经典方剂，该方临床应用广泛，多用于治疗阿尔茨海默病、糖尿病、心血管疾病及中风等一系列疾病[1]，应用十分广泛。地黄饮子由熟地黄、山茱萸、五味子、巴戟天、麦冬、薄荷、石菖蒲、石斛等15味药材组成。目前地黄饮子主要集中在动物AD(阿尔茨海默病)模型的药效学研究[2]和血中移行成分研究的血清药物化学方面[3]，而体外成分的质量控制研究较少。由于复方制剂组方药材较多成分复杂，其药效不仅仅取决于某个成分，因此本实验立足于对地黄饮子的指纹图谱进行研究，找出共有成分，为其更加准确全面的进行质量控制提供理论依据。

1 仪器与试药

Wasters600-996 高效液相色谱仪(二级管阵列检测器)；TGL-16G-C高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；H66MC型超声震荡仪(昆山市超声仪器有限公司)；熟地黄、山茱萸、五味子、巴戟天、麦冬、薄荷、石菖蒲、石斛、远志、附子、肉苁蓉、茯苓、肉桂、大枣、姜(购于哈尔滨三棵树药材市场，经黑龙江中医药大学谢宁教授鉴定为正品)；自制10批地黄饮子(按生产日期编制批次)；乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯，美国迪马公司)；甲酸胺(分析纯，天津科密欧试剂有限公司)；马钱苷对照品(批号：111640-201707 ，中国食品药品检定研究院)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Shim-pack XR-ODSⅡ2.0 mmid×75 mm(SHIMADZU)；流动相：采用乙腈(A)-0.1%甲酸+10 mmoL·L-1甲酸胺(B)体系，梯度洗脱程序为乙腈浓度梯度5.0%(0 min)，5.0%～50%(0～10 min)，50%～80%(10～15 min)，80%～95%(15～17 min)。柱温：30℃；流量：0.3 mL-1；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取马钱苷对照品10 mg，分别置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度摇匀即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取地黄饮子组成15味药材各15 g，混匀粉碎，粉末放于烘箱中烘至恒重，取地黄饮子粉末1 g或单味药材粉末66 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度定容，浸泡20 min后超声30 min，上清液3000 r ·min-1离心15 min，过0.45 μm滤膜，取续滤液作为样品溶液。

2.3 精密度试验 取同一批地黄饮子粉末，按2.2.2项下供试品制备方法制备样品溶液，连续进样5次，按2.1项下色谱条件测定。结果表明，共有峰的保留时间RSD(%)小于1%，峰面积的RSD(%)小于1%，符合指纹图谱要求。

2.4 重复性试验 取自制5批地黄饮子粉末，按2.2.2项下供试品制备方法制备样品溶液，平行制备5份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，结果各共有峰峰面积的RSD(%)小于1%，保留时间的RSD小于1%，表明方法重现性良好，符合指纹图谱的要求。

2.5 稳定性试验 取上述地黄饮子粉末，按2.2.2项下供试品制备方法制备样品溶液，按2.1项下色谱条件分别在0、4、8、16、24 h进行测定。结果表明，各共有峰的保留时间和峰面积的RSD(%)均小于1%，表明样品在24 h内稳定性良好。

3 地黄饮子指纹图谱的建立

取10批自制地黄饮子粉末，按2.2.2项下供试品制备方法制备样品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，采集指纹图谱(见图-1)，以马钱苷峰作为参照峰(S峰)，共选取标定了18个共有峰(共有峰总面积占总峰面积的 70%以上)(见图2)。计算各共有峰峰面积与参照峰峰面积的比值(相对峰面积)，并使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A 版)》，对10 批地黄饮子指纹图谱进行相似度评价，设置样品参照谱，采用平均数法生成对照指纹图谱，手动多点校正，不同批次的相似度在0.889～0.979之间。见表1。

图2 地黄饮子复方样品 HPLC-DAD指纹图谱共有模式

图1 十批次地黄饮子复方样品HPLC-DAD指纹图

表1 指纹图谱相似度计算结果

表1 指纹图谱相似度计算结果

4 主要色谱峰的鉴定

按与样品相同的色谱条件分析得到马钱苷对照品的HPLC色谱图。采用保留时间对照法，对样品中5号成分进行定性分析，采用HPLC-DAD紫外检测技术，将所得图谱的形状、吸收带位置及相对强度与马钱苷对照品紫外光谱图进行比较。发现5号峰保留时间和紫外光谱图均与马钱苷相同(见图3、图4)，所以确定5号成分为马钱苷。

A马钱苷 B地黄饮子复方样品图3 地黄饮子复方样品、马钱苷UPLC-DAD色谱图比较(254nm)

A马钱苷 B地黄饮子复方样品5号峰图4 马钱苷与地黄饮子复方样品5号峰紫外吸收光谱图比较

5 讨论

本实验考察有机相：甲醇、乙腈和水相：水、磷酸水、0.1%甲酸+10 mmoL·L-1甲酸胺体系，实验结果表明乙腈-0.1%甲酸+10mmoL·L-1甲酸胺体系所得色谱图中色谱峰较多且分离度较好，故选用此体系。采用二极管阵列检测器，考察220 nm、240 nm、254 nm、280 nm、300 nm和330 nm处的图谱特征，当波长为254 nm时，成分较多且基线平滑，最终确定波长为254 nm。

地黄饮子具有滋肾阴、补肾阳、开窍化痰的功效，多用于脑血栓、脑血管意外、中风、泛发性神经皮炎、老年病等多种脑部疾病的治疗。山茱萸具有补益肝肾的功效，与地黄饮子滋肾阴、补肾阳之功效相吻合。而马钱苷属环烯醚萜苷类，是山茱萸中的主要药效成分之一，对神经系统具有镇静、抗惊厥的作用，对非特异性免疫功能也有增强作用，能促进巨噬细胞吞噬功能，延缓衰老[4]，这与地黄饮子用于脑部疾病的功用相吻合。对于其他17种共有成分同样可依据上述的保留时间，紫外图谱对照法，进行进一步的定性分析研究，从而为地黄饮子体外质量控制研究提供更加全面的依据。