茵陈草水提物对四氯化碳致大鼠肝纤维化的干预作用

邵敏敏 毛 毛 梁 韬

茵陈草（Artemisia dracunculus L.）为菊科多年生丛生型芳香草本植物，别名白蒿，性微寒、味苦辛，具有清湿热、退黄疽，保肝利胆的作用[1]。民间主要用于保肝利胆、肝纤维化的治疗[2]。但其对抗肝纤维化的作用机制鲜见报道。本研究基于前期的预实验基础，采用四氯化碳诱导建立肝纤维化大鼠模型，探究茵陈草水提物对肝纤维化大鼠的保护作用及作用机制。

1 实验材料

1.1 动 物 SD 大鼠，SPF 级，雌雄各半，体质量（180～220）g，浙江大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证∶SYXK（浙）2018-0016，实验动物生产许可证∶SCXK（浙）2018-0006。大鼠饲养于通风良好的环境，室温18～25℃，相对湿度40%～70%，12h 光照昼夜循环。实验开始前大鼠进行适应性喂养1 周。

1.2 药 物 茵陈草水提物制备∶茵陈草4kg 干燥粗粉，加入40L 蒸馏水90℃下加热回流提取2h，纱布过滤，滤渣继续加入40L 蒸馏水90℃下加热回流提取2h，连续水煮3 次，纱布过滤后，将每次的滤液合并，然后采用微波真空干燥器浓缩至2L 浓缩液，茵陈草水提物的浓度（含生药量）∶2g/mL。

1.3 试 剂 四氯化碳（分析纯）∶成都市科隆化工试剂厂，批号20 170926；丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒，批号20190517、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒，批号20190606，南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA 试剂盒，批号190718，白介素-1β（IL-1β）ELISA 试剂盒，批号190525，上海酶联生物科技有限公司；水飞蓟素胶囊∶德国马博士大药厂，批号B180156。透明质酸（HA）试剂盒，批号 190324；III 型前胶原（PCIII）试剂盒，批号 190314；层粘连蛋白（LN）试剂盒，批号 190405；IV 型胶原（IV-C）试剂盒，批号190329，均购自南京建成生物工程研究所。

1.4 主要仪器 9602A-酶标仪（北京艾普生设备有限公司）；UVmini-1240 型紫外-可见分光光度（岛津国际贸易上海有限公司）；TGL-16G 高速台式冷冻离心机（杭州汇尔仪器设备有限公司）。

2 实验方法

2.1 大鼠肝纤维化模型建立[3]将70 只SD 大鼠随机抽取10 只为正常组。其余大鼠腹腔注射四氯化碳与花生油混合溶液（1:1）1mL/kg，每周注射2 次，连续注射8 周。末次注射1 天后，抽取10 只大鼠，对其肝脏进行Masson 染色，观察其病理学变化，确认大鼠肝纤维化造模成功。

2.2 分组及给药 使用随机数字表法随机将50 只肝纤维化模型大鼠分为模型组、阳性药水飞蓟素40mg/kg 组[4-5]、茵陈草水提物2.5、5、10g/kg 剂量组，每组10 只。灌胃给药，每天1 次，连续给药56 天。模型组、正常组大鼠每天灌胃等体积生理盐水。

2.3 HE 染色方法 石蜡切片（厚度3μm）在二甲苯中脱蜡10min，移入二甲苯与纯酒精（1:1）的混合液中5min，用酒精按常规逐级脱水，苏木精染液染色10min，水洗玻片上多余的染液，0.5%盐酸酒精分色，蒸馏流水冲洗15min 后蒸馏水短洗，0.5%伊红染液染色5min，酒精常规逐级脱水，二甲苯透明，封片。

2.4 Masson 染色法 石蜡切片在二甲苯中脱蜡10min，移入二甲苯与纯酒精（1:1）的混合液中5min，用酒精按常规逐级脱水，苏木精染液染色10min，水洗玻片上多余的染液，0.5%盐酸酒精分色，蒸馏流水冲洗15min 后蒸馏水短洗，用Masson 丽春红酸性复红液10min，以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷钨酸水溶液分化5min，不经水洗,直接用苯胺蓝液染5min。以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。

2.5 指标检测 末次给药4h 后，3%苯巴比妥钠腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，离心提取血清。剥离肝脏，切取部分放置于10%福尔马林溶液固定，包埋切片，HE 染色及Masson 染色观察大鼠肝脏的病理学变化和纤维化程度。比色法检测大鼠血清AST、ALT 含量，ELISA 法检测TNF-α、IL-1β 表达量。比色法检测肝脏透明质酸（HA），III 型前胶原（PCIII），层粘连蛋白（LN）、IV 型胶原（IV-C）含量。

2.6 肝脏纤维化程度分级 根据全国肝病会议（西安）通过的标准[6]，将肝脏纤维化病变程度分为5 个级别∶S0∶无肝脏纤维化病变；S1∶肝脏汇管区纤维化扩大，限局窦周及小叶内纤维化；S2∶肝脏汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留；S3∶肝脏纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；S4∶出现早期肝硬化。

3 实验结果

3.1 各组大鼠肝组织病理学变化和纤维化程度 HE染色以及Masson 染色结果显示，正常组大鼠肝小叶结构正常，汇管区血管壁清晰，未见有胶原纤维。模型组大鼠肝细胞排列紊乱，有明显坏死及大量胶原纤维出现。水飞蓟素、茵陈草水提物各剂量组肝细胞排列相对有序，细胞结构和形态有所恢复，胶原纤维均有所减少。见插页图1-2。

3.2 各组大鼠肝组织纤维化程度比较 各组大鼠肝组织病理分级比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3.3 各组大鼠血清ALT、AST 水平比较 与正常组比较，模型组大鼠血清ALT、AST 水平显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，水飞蓟素、茵陈草水提物各剂量组血清ALT、AST 水平降低（P 均＜0.05）。见表2。

表1 各组大鼠肝组织纤维化程度比较（例）

表2 各组大鼠血清ALT、AST 水平比较（U/mL，）

表2 各组大鼠血清ALT、AST 水平比较（U/mL，）

注∶正常组为健康大鼠，予生理盐水；模型组为肝纤维化模型大鼠，予生理盐水；水飞蓟素组为肝纤维化模型大鼠予40mg/kg 水飞蓟素混悬液；茵陈草水提物高剂量组为肝纤维化模型大鼠予10g/kg 茵陈草水提物混悬液；茵陈草水提物中剂量组为肝纤维化模型大鼠予5g/kg茵陈草水提物混悬液；茵陈草水提物低剂量组为肝纤维化模型大鼠予2.5g/kg 茵陈草水提物混悬液；ALT 为丙氨酸氨基转移酶；ALT 为天门冬氨酸氨基转移酶；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与水飞蓟素组比较，cP＜0.05；与茵陈草水提物高剂量组比较，dP＜0.05

3.4 各组大鼠肝组织TNF-α、IL-1β 表达量比较与正常组比较，模型组大鼠肝组织TNF-α、IL-1β 含量显著增加（P＜0.05）。与模型组比较，水飞蓟素、茵陈草水提物各剂量组肝组织TNF-α、IL-1β 含量下降（P 均＜0.05）。见表3。

3.5 各组大鼠肝组织HA、PCIII、LN、IV-C 水平比较与正常组比较，模型组大鼠肝组织HA、PCIII、LN、IV-C 含量显著增加（P＜0.05）。与模型组比较，水飞蓟素、茵陈草水提物各剂量组肝组织HA、PCIII、LN、IV-C 含量下降（P 均＜0.05）。见表4。

4 讨论

肝纤维化是各种致病因子造成肝脏受损后，肝组织在修复过程中代偿反应而形成肝内纤维结缔组织异常增生的病理生理过程，是各种慢性肝病向肝硬化、肝功能衰竭等肝脏疾病发展所共有的病理变化和必经之路[7]。ALT、AST 是衡量肝脏代谢功能重要的酶，当肝脏出现受损、坏死时，ALT、AST 会从肝细胞内溢出而进入到血液中，致血液中ALT、AST 含量升高[8]。本研究结果表明，茵陈草水提物干预后大鼠血清ALT、AST 的含量明显下降，提示大鼠的肝脏代谢功能有所恢复。HE 染色结果表明，茵陈草水提物干预后肝脏炎症细胞浸润减少，细胞结构和形态较完整，排列相对整齐。这与大鼠肝脏代谢功能有所恢复的结果相一致。

表3 各组大鼠肝组织TNF-α、IL-1β 表达量比较（pg/mL，）

表3 各组大鼠肝组织TNF-α、IL-1β 表达量比较（pg/mL，）

注∶正常组为健康大鼠，予生理盐水；模型组为肝纤维化模型大鼠，予生理盐水；水飞蓟素组为肝纤维化模型大鼠予40mg/kg 水飞蓟素混悬液；茵陈草水提物高剂量组为肝纤维化模型大鼠予10g/kg 茵陈草水提物混悬液；茵陈草水提物中剂量组为肝纤维化模型大鼠予5g/kg茵陈草水提物混悬液；茵陈草水提物低剂量组为肝纤维化模型大鼠予2.5g/kg 茵陈草水提物混悬液；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-1β为白介素-1β；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与水飞蓟素组比较，cP＜0.05；与茵陈草水提物高剂量组比较，dP＜0.05

肝损伤是肝纤维化发生的始动因素，而肝纤维化是肝炎发展为肝硬化的中心环节[9]。受损的肝细胞通常会释放多种炎症因子，肝星状细胞受炎症因子刺激后释放大量的细胞外基质（ECM），导致大量胶原因子活化及沉积，造成肝纤维化形成[10]。ECM 在肝脏中的平衡与降解是一个动态的过程，这一过程对肝纤维化的形成起着关键的作用，而对肝纤维化指标的检测可直观的体现这一动态过程[11]。HA、LN 的活化为肝星状细胞受炎症因子刺激后而大量形成，其生产的速度远大于机体对HA 的清除速度时，造成HA、LN 在肝脏中的堆积[12-13]。PCIII、IV-C 含量与肝纤维化程度密切相关，能够反映其合成状况，也是炎症活动性指标[14-15]。本研究结果表明，茵陈草水提物干预后大鼠肝组织炎症因子TNF-α、IL-1β 和胶原因子HA、PCIII、LN、IV-C 含量显著下降，表明茵陈草水提物可下调肝脏中炎症因子和胶原因子的含量，这与Masson 染色结果中茵陈草水提物干预组的胶原纤维减少相一致。本研究结果还显示，随着茵陈草水提物给药剂量的加大，TNF-α、IL-1β、HA、PCIII、LN、IV-C 含量下降幅度也随着增大，表明剂量与各指标的值存在一定的线性关系。

表4 各组大鼠肝组织HA、PCIII、LN、IV-C 水平比较（μg/L，）

表4 各组大鼠肝组织HA、PCIII、LN、IV-C 水平比较（μg/L，）

注∶正常组为健康大鼠，予生理盐水；模型组为肝纤维化模型大鼠，予生理盐水；水飞蓟素组为肝纤维化模型大鼠予40mg/kg 水飞蓟素混悬液；茵陈草水提物高剂量组为肝纤维化模型大鼠予10g/kg 茵陈草水提物混悬液；茵陈草水提物中剂量组为肝纤维化模型大鼠予5g/kg 茵陈草水提物混悬液；茵陈草水提物低剂量组为肝纤维化模型大鼠予2.5g/kg 茵陈草水提物混悬液；HA 为透明质酸；PCIII 为III 型前胶原；LN 为层粘连蛋白；IV-C 为IV 型胶原；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与水飞蓟素组比较，cP＜0.05；与茵陈草水提物高剂量组比较，dP＜0.05

总之，茵陈草水提物能使纤维化大鼠肝功能和病理损伤得到明显的改善，其作用机制可能为通过减少肝纤维化大鼠中胶原因子HA、PCIII、LN、IV-C的含量，减少胶原纤维的形成，同时减少炎症因子TNF-α、IL-1β 的含量，缓解肝组织炎症损伤，从而达到对纤维化模型大鼠肝组织纤维化改善作用。