水飞蓟素抑制二氧化硅诱导的小鼠的肺纤维化过程*

沈链链，杨 健，钟义红，徐 彬，王玉邦

(1.江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心，江苏 南京 211166；2.南京医科大学第二附属医院泌尿外科)

肺纤维化是不断进展的疾病，由早期的炎症发展成为肺部的瘢痕，其特征是细胞外基质的异常过度沉积，最终发展成为丧失肺功能的纤维化组织[1]。肺纤维化的发病率较高，尤其是采矿工人以及暴露于石棉和金属粉末的职业人员。目前治疗肺纤维化的药物主要有皮质类固醇激素和细胞毒性因子等。这些药物不仅存在一定的毒副作用，而且对于疾病而言，并没有可测量到的实质性的改善[2]。对于新药物而言，降低其毒作用非常关键。水飞蓟素是从水飞蓟种子中提取的一种混合物，包含水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟汀等。水飞蓟素具有很多生化和药理学功能，包括抗氧化功能，稳定肝细胞膜的功能，促进重建的功能[3]，水飞蓟素能减缓肝纤维化过程，提高存活率[4]。有研究显示水飞蓟素对胆道纤维化也可能有效[5]。但水飞蓟素对肺部疾病的疗效仍不确切。由于不同脏器的纤维化过程的机制有许多共性，而水飞蓟素对肝纤维化有确切疗效，因此我们推测其对肺纤维化也可能有一定的干预作用。因此，该研究运用小鼠模型，研究水飞蓟素对二氧化硅(SiO2)所致肺纤维化的抑制作用。本实验另设置了药物汉防己甲素组，用于明确水飞蓟素对肺纤维化的疗效，汉防己甲素是一种生物碱，在临床上用于治疗矽肺已有很多年[6]。

1 材料和方法

1.1试剂 SiO2和水飞蓟素(Sigma公司)；汉防己甲素(浙江康恩贝生物制药有限公司)；兔抗平滑肌肌动蛋白-α(smooth muscle actin，α-SMA)(Proteintech Group，Inc)；兔抗转化生长因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)(Bioworld Technology)。

1.2实验动物及剂量 雄性C57BL/6J 小鼠20～23 g购自扬州大学比较医学中心。所有动物在实验前检疫3 d；动物饲养于IVC动物房，温度为(24±3)°C，湿度为(55±6)%，光照为12 h(明)：12 h(暗)交替；食物和水自由摄取。动物被随机分为6组，每组10只。本实验用气管灌注SiO2形成肺纤维化模型：小鼠经水合氯醛麻醉后切开颈部皮肤，分离肌肉，暴露气管，注射器吸取50 μL SiO2悬液(50 mg/mL，用生理盐水重悬)灌注于气管，灌注完成后，缝合伤口。水飞蓟素用蒸馏水配置，剂量设置为200 mg/kg[7-8]以及100 mg/kg。各组小鼠的处理如下表所示，所有动物在第0 d、第 4 d称重，之后一周一次称重。见表1。

表1 气管灌注及灌胃日程

1.3肺系数 灌胃28 d结束后，小鼠隔夜禁食，第2 d用颈椎脱臼法处死，分离肺，用生理盐水将其洗净后用滤纸吸干水分，称重；肺系数按照如下公式计算：肺系数=(肺湿重/小鼠体重)×100 %；左肺叶切下后保存于福尔马林溶液。

1.4病理组织分析 经固定、脱水、包埋后切成4 μm切片；经HE染色后，纤维化的严重程度用一种改良的半定量的方法进行评分[9]；Masson染色观察胶原沉积，Masson染色后，肌肉染成红色而胶原染成蓝色，切片用Pannoramic Scan切片扫描系统扫描成像。

1.5免疫组化 石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，根据MaxVision公司(迈鑫,中国)的MaxVision TM plus Poly HRP IHC Kit试剂盒步骤操作。主要步骤如下：微波抗原修复，3 % H2O210 min用于去除内源性过氧化物酶；切片经PBS清洗，孵育α-SMA 或者 TGF-β1抗体(1∶500)4 ℃过夜；经PBS洗，室温孵育MaxVisionTM试剂15 min；加0.02 % DAB显色；自来水冲洗；苏木素复染；PBS冲洗返蓝。切片用Pannoramic Scan切片扫描系统扫描成像。

2 结果

2.1小鼠体重 水飞蓟素低剂量组的第4 d、第11 d、第25 d的体重与空白对照组(或生理盐水组)相比，体重降低且差异有统计学意义(P<0.05)，但最终体重与对照组或生理盐水组比较，差异无统计学意义(P=0.075，0.072)。见表2。

2.2水飞蓟素灌胃对肺湿重和肺系数的影响 模型组较生理盐水组，小鼠肺湿重、肺系数升高(P肺湿重=0.000，P肺系数=0.000)；汉防己甲素逆转了上述指标升高的趋势，基本接近对照组水平；高剂量水飞蓟素组灌胃28 d后较模型组也有效地抑制了肺湿重和肺系数升高(P肺湿重=0.020，P肺系数=0.019)，提示高剂量水飞蓟素可能对肺纤维化有抑制作用。低剂量水飞蓟素与模型组相比，两项指标均无统计学差异(P=0.931，0.626)。见图1。

表2 各组小鼠体重(g)

注：“*”表示各组与空白对照组比较P<0.05，“#”表示各组与生理盐水组比较P<0.05

图1

注：(A)肺湿重，(B)肺系数；“*”表示各处理组与生理盐水组比较P<0.05，“#”表示各处理组与SiO2组比较P<0.05；(Sil-L：水飞蓟素 100 mg/kg剂量组， Sil-H：水飞蓟素 200 mg/kg剂量组，Tet：汉防己甲素组)。

2.3水飞蓟素灌胃后的病理改变 图2A-F所示，对照组的小鼠的肺组织有完整、清晰的肺泡结构以及正常的间隙，未观察到炎细胞。与对照组相比，灌注生理盐水的小鼠几乎没有病理组织学改变，而灌注SiO2的小鼠出现了矽结节，肺泡结构改变。汉防己甲素灌胃使绝大部分肺泡结构恢复。低剂量水飞蓟素有一定的效果，但并不明显，而高剂量的水飞蓟素显著减轻了由SiO2所致的病理组织学的改变。如图2G所示，两剂量水平的水飞蓟素灌胃后肺纤维化评分低于模型组的评分(P低剂量=0.006，P高剂量=0.000)。仅从纤维化评分来看，高剂量水飞蓟素甚至与汉防己甲素效果相当。见图2。

图2 HE染色及纤维化评分

注：(A)对照组，(B)生理盐水组，(C)SiO2组，(D)水飞蓟素100 mg/kg剂量组，(E)水飞蓟素200 mg/kg剂量组，(F)汉防己甲素组，标尺=200 μm；(G)纤维化评分。“*”表示各处理组与生理盐水组比较P<0.05，“#”表示各处理组与SiO2组比较P<0.05；(Sil-L：水飞蓟素 100 mg/kg剂量组， Sil-H：水飞蓟素 200 mg/kg剂量组，Tet：汉防己甲素组)。

2.4水飞蓟素对胶原沉积的影响 对照组以及生理盐水组并无胶原沉积，而模型组有明显的胶原沉积(蓝色为胶原纤维)。灌胃汉防己甲素后，胶原沉积明显减少，而灌胃两种剂量水平的水飞蓟素后胶原沉积也有所减少，尤其是高剂量组。见图3。

2.5水飞蓟素对α-SMA和TGF-β1表达的影响 对照组和生理盐水组几乎没有a-SMA和 TGF-β1的表达。而模型组的小鼠a-SMA和 TGF-β1的表达都显著上升。而200 mg/kg的水飞蓟素以及汉防己甲素组能减少其表达。见图4、图5。

3 讨论

小鼠经SiO2气管灌注后肺湿重和肺指数显著升高，而高剂量的水飞蓟素灌胃能降低这两项指标，提示高剂量的水飞蓟素可能对SiO2所致的肺纤维化有较好的效果。

SiO2气管灌注后引起了一系列病理组织学改变，Ashcroft评分结果也显著高于对照组。胶原沉积是肺纤维化过程中的重要的致病过程之一。本研究结果显示SiO2气管灌注后胶原明显增多。而水飞蓟素灌胃后减少了病理组织学改变，降低了纤维化评分，减少了胶原沉积，而且高剂量的水飞蓟素与低剂量的水飞蓟素相比，其作用更加显著。这也更加证实了水飞蓟素的抗纤维化效果。

图3 Masson染色

注：(A)对照组，(B)生理盐水组，(C) SiO2组，(D)水飞蓟素100 mg/kg剂量组，(E)水飞蓟素200 mg/kg剂量组，(F)汉防己甲素组。标尺=100 μm。

图4 α-SMA免疫组化

注：(A)对照组，(B)生理盐水组，(C)SiO2组，(D)水飞蓟素100 mg/kg剂量组，(E)水飞蓟素200 mg/kg剂量组，(F)汉防己甲素组。标尺=100 μm。

在肺纤维化的过程中，来源于上皮细胞的肌成纤维细胞是最重要的致病相关的细胞[10]。肌成纤维细胞有很强的合成胶原的能力，其特征就是ɑ-SMA的表达。运用免疫组化技术发现水飞蓟素灌胃能降低ɑ-SMA的表达水平，这也证实了水飞蓟素可能有抑制肺纤维化的作用。

图5 TGF-β1免疫组化

注：(A)对照组，(B)生理盐水组，(C)SiO2组，(D)水飞蓟素100 mg/kg剂量组，(E)水飞蓟素200 mg/kg剂量组，(F)汉防己甲素组。标尺=100 μm。

TGF-β1能够诱导完全分化的上皮细胞经历间质细胞的转化后，再生成成纤维细胞和肌成纤维细胞，并且保护肌成纤维细胞不凋亡[10]。TGF-β1可以看作纤维化过程的重要开关[11]，因此抑制它能有效地抑制纤维化的进程[12]。该研究证实灌胃水飞蓟素能有效地减少TGF-β1的表达，这也证实水飞蓟素可能对SiO2所致的纤维化过程有抑制作用。

虽然水飞蓟素的抗纤维化效果没有汉防己甲素强，但是相对于汉防己甲素来说，其副作用较少，因此相对比较安全[3]。这一点很重要，因为基于水飞蓟素的抗纤维化作用而且副作用较小，可能被作为一种预防或治疗肺纤维化的保健品开发。