芹菜素对大鼠烧伤创面微循环改善作用的研究

戴如冰 陈 骅 凌书建

烧伤是一种因热力，如火、热气、热液体等所致的人体组织器官损伤，发病率居外伤疾病谱第四位，具有非常高的致死率及致残、致畸率，给家庭和社会造成危害[1]。皮肤是烧伤最易损伤的组织，根据组织病变，皮肤创面可分为凝固区、瘀滞区和充血区三个区带[2]，而微血栓形成及局部水肿所致瘀滞区组织进行性坏死将导致创面加深[3]，从而增加治疗难度并影响治疗预后。所以改善创面组织微循环、挽救瘀滞区组织细胞，是提高烧伤预后的关键。既往研究发现，黄酮类化合物具有改善局部微循环的作用[4-5]。芹菜素是天然存在的一种具有多种生物学活性的黄酮类化合物。本实验以深II 度烧伤大鼠模型为研究对象，研究芹菜素对大鼠烧伤创面微循环的影响并探索其可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 180 只无病原微生物级（SPF 级）雄性Wistar 大鼠，8 周龄，体质量（220～250）g，由河北省实验动物中心提供[许可证号∶SCXK（冀）2018-004]；清洁级环境分笼饲养，饲养条件∶12h 光照黑暗交替、温度（25±1）℃、相对湿度（60±5）%，自由饮水进食，1 周后开展实验。所有大鼠进行编码后按照随机数字表法随机分为假烧伤组，模型组，磺胺嘧啶银软膏单药组，磺胺嘧啶银软膏+芹菜素低、中、高剂量组（12.5、25、50mg/kg），各30 只。本实验通过中国人民武装警察部队海警总队医院伦理委员会审核，伦理批件号∶HJLL[K]字2019-026，实验过程严格按照伦理审批通过的方案执行。

1.2 药物与试剂 芹菜素购自陕西慧科植物开发有限公司（批号190524，纯度≥98%）；磺胺嘧啶银软膏购自沈阳红旗制药有限公司（规格∶1%，批号181225）；乳酸钠林格注射液购自安徽双鹤药业有限公司（批号20190426）；兔抗鼠表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、β-actin 单克隆抗体购自上海碧云天生物技术有限公司（批号201904015、201905027、201905009、20190514）；ECL 超敏化学发光液购自美国Thermo Fisher Scientific 公司（批号EB190217）。

1.3 主要仪器 YLS-5Q 型烫伤仪（天津科技发展有限公司）；LISCA 型激光多普勒血液灌流成像仪（瑞典Perimed 公司）；Allegra 21R 型低温离心机（美国Beckman 公司）；CUT 4050 型旋转切片机（德国Leica 公司）；Tetra Systerm 型垂直电泳槽、Power Pac Basic 转膜槽（美国Bio-Rad 公司）；CKX41 型倒置光学显微镜（日本Olympus 公司）。

2 实验方法

2.1 药物制备 磺胺嘧啶银软膏+芹菜素低、中、高剂量组，芹菜素给药剂量分别为12.5、25、50mg/kg，为了保持注射给药体积一致，均为2mL/kg，将芹菜素配制成浓度为6.25、12.5、25mg/mL 的溶液。

2.2 模型制备与给药 参照郑国钰等[6]报道的实验方法制备深II 度烧伤大鼠模型。各组大鼠禁食禁水12h 后，腹腔注射水合氯醛溶液（浓度10%，剂量0.3mL/100g）实施麻醉，剃除背部毛发后用8%的Na2S 溶液脱毛，温水冲洗并用75%乙醇消毒，假烧伤组立即腹腔注射乳酸钠林格溶液5mL 抗休克；其余各组大鼠均采用烫伤仪制备深II 度烧伤大鼠模型，参数设置为∶压力0.03MPa、温度106℃持续时间5s，通过病理切片证实造模成功（病理切片呈现∶部分真皮层内细胞坏死，部分毛囊等附件残存，毛细血管扩张、管腔可见红细胞及血液瘀滞）（见插页图1）。造模完成后各组大鼠立即腹腔注射乳酸钠林格溶液5mL抗休克。假烧伤组和模型组腹腔注射0.9%氯化钠溶液2mL/kg，每天1 次；磺胺嘧啶银软膏单药组于烧伤皮肤涂抹磺胺嘧啶银软膏，每2 天换药1 次，腹腔注射0.9%氯化钠溶液2mL/kg，每天1 次；磺胺嘧啶银软膏+芹菜素低、中、高剂量组于烧伤皮肤涂抹磺胺嘧啶银软膏，每2 天换药1 次，并分别腹腔注射浓度为6.25、12.5、25mg/mL 的芹菜素溶液2mL/kg，每天1次；疗程14 天。

2.3 创面大体情况观察及创面组织病理学检查 治疗14 天后观察各组大鼠烧伤创面状况，包括皮肤颜色、结痂状况、分泌物、愈合状况等；各组分别随机取10 只大鼠，麻醉后颈椎脱臼致死，切取创面皮肤组织，置4%多聚甲醛溶液72h 实施固定，经梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片（厚度5μm）后行HE 染色、梯度酒精脱蜡、二甲苯透明后中性树脂封片，然后通过光学显微镜观察。

2.4 创面愈合率计算 各组分别随机取10 只大鼠，分别于给药第0、14 天烧伤创面拍照，计算创面面积，创面愈合率（%）=（1-未愈创面面积/初始创面面积）×100%。

2.5 创面组织微循环血流灌注值（MPD）测定[7]取2.4 步骤的10 只大鼠，恒温25℃环境下，通过激光多普勒血液灌流成像仪测定创面组织MPD 值，仪器参数设置∶扫描速度100ms/Line、扫描宽度64 像素、轮廓50 像素、视距12cm、显示频率5Hz，每只大鼠扫描5 次（扫描间隔为5s）取平均值。

2.6 创面组织微血管密度（MVD）测定[8]取2.3 步骤制备的创面组织HE 染色病理切片，在200 倍倒置光学显微镜下，每张切片于微血管丰富处选取互不重叠的5 个视野计数微血管数量，然后分别取平均值。

2.7 创面组织含水量测定 取2.5 步骤的10 只大鼠，麻醉后颈椎脱臼致死，切取创面皮肤组织，冲洗干净后称重（W1），置80℃烤箱烘烤24h 至恒重后称量（W2），含水量（%）=[（W1-W2）/W1]×100%。

2.8 创面组织EGF、bFGF、VEGF 蛋白表达量测定各组分别取剩余的10 只大鼠，麻醉后颈椎脱臼致死，切取创面皮肤组织，于冰上剪碎后，加入9 倍量冷裂解液行研磨匀浆，恒4℃离心（12000rpm，15min）取上清，BCA 法测定总蛋白含量后，行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、湿法转PVDF 膜、5%脱脂奶粉37℃封闭1h，滴加兔抗鼠EGF、bFGF、VEGF 单抗（稀释倍数1:3000）和兔抗鼠β-actin 单抗（稀释倍数1:1000）后4℃孵育12h，洗膜后滴加山羊抗兔IgG 二抗（稀释倍数1:500，37℃振荡孵育1h，PBS 洗膜后滴加ECL 显色发光，运用凝胶成像系统获得条带；以β-actin 为内参，以条带灰度值对目标检测蛋白进行半定量分析。

2.9 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件，实验数据以均数±标准差（） 表示，行方差齐性检验，方差齐分组均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较行t 检验，方差不齐采用Tamhane's t2检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 芹菜素对深II 度烧伤大鼠创面大体情况的影响 给药治疗14 天后观察发现，假烧伤组大鼠创面毛发生长茂盛，毛发长度已基本恢复；模型组创面新生肉芽较少、结痂厚度不均匀，部分基底仍有黄色液体渗出；磺胺嘧啶银软膏单药组创面缩小、大部分痂下愈合，无渗出；磺胺嘧啶银软膏+芹菜素低、中、高剂量组创面呈不同程度缩小、大部分痂下愈合，无渗出，新愈合皮肤红润，毛发开始生长，其中磺胺嘧啶银软膏+芹菜素高剂量组效果最为显著。

3.2 芹菜素对深II 度烧伤大鼠组织病理性形态结构变化的影响 给药治疗14 天后行HE 染色发现，假烧伤组未见明显异常，模型组可见坏死组织以及炎性细胞浸润，出现较薄的新生上皮组织；磺胺嘧啶银软膏单药组和磺胺嘧啶银软膏+芹菜素低、中、高剂量组上皮组织成熟较好、排列整齐，汗腺、皮脂腺等结构较为完整但仍较表浅；其中磺胺嘧啶银软膏+芹菜素高剂量组可见表皮生成，上述效果相对最好。见插页图2。

3.3 芹菜素对深II 度烧伤大鼠创面愈合率的影响磺胺嘧啶银软膏组和磺胺嘧啶银软膏+芹菜素低、中、高剂量组愈合率均升高，与模型组比较，差异均有统计学意义（P 均＜0.01）；与磺胺嘧啶银软膏单药组比较，磺胺嘧啶银软膏+芹菜素中、高剂量组愈合率显著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。见表1。

3.4 芹菜素对深II 度烧伤大鼠创面MPD、MVD 的影响 模型组MPD、MVD 较假烧伤组显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，磺胺嘧啶银软膏单药组和磺胺嘧啶银软膏+芹菜素低、中、高剂量组MPD、MVD 均显著增加（P＜0.05 或P＜0.01）；与磺胺嘧啶银软膏单药组比较，磺胺嘧啶银软膏+芹菜素中、高剂量组MPD、MVD 显著增加（P＜0.01）。见表2。

表1 芹菜素对深II 度烧伤大鼠创面愈合率的影响（%，）

表1 芹菜素对深II 度烧伤大鼠创面愈合率的影响（%，）

注∶假烧伤组、模型组予腹腔注射0.9%氯化钠溶液2mL/kg；磺胺嘧啶银软膏单药组予烧伤皮肤涂抹磺胺嘧啶银软膏并腹腔注射0.9%氯化钠溶液2mL/kg；磺胺嘧啶银软膏+芹菜素低、中、高剂量组予烧伤皮肤涂抹磺胺嘧啶银软膏并分别腹腔注射6.25、12.5、25mg/mL 浓度的芹菜素溶液2mL/kg；与模型组比较，aP＜0.01；与磺胺嘧啶银软膏单药组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01

3.5 芹菜素对深II 度烧伤大鼠创面组织含水量的影响 模型组创面组织含水量较假烧伤组显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，磺胺嘧啶银软膏+芹菜素中、高剂量组含水量显著降低（P＜0.01）；磺胺嘧啶银软膏+芹菜素高剂量组含水量较磺胺嘧啶银软膏单药组显著降低（P＜0.05）。见表2。

3.6 芹菜素对深II 度烧伤大鼠创面组织EGF、bFGF、VEGF 蛋白表达的影响 与假烧伤组比较，模型组、磺胺嘧啶银软膏单药组和磺胺嘧啶银软膏+芹菜素低、中、高剂量组EGF、bFGF、VEGF 蛋白表达量均显著上调（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组比较，磺胺嘧啶银软膏+芹菜素低、中、高剂量组EGF、bFGF、VEGF 表达量显著上调（P＜0.05 或P＜0.01）；磺胺嘧啶银软膏+芹菜素中、高剂量组EGF、bFGF、VEGF 表达量较磺胺嘧啶银软膏单药组显著上调（P 均＜0.01）。见表3、插页图3。

4 讨论

烧伤后创面微循环障碍是导致创面加深、迁延不愈而影响预后的重要原因，所以改善局部微循环对烧伤创面治疗意义重大。胡泽华等[8]、林建昌等[9]、冯智才等[10]研究发现，通过药物干预改善烧伤创面微循环对创面愈合具有促进作用。既往研究发现，芹菜素能够通过上调VEGF 表达以促进血管新生以及改善血流动力学、血液流变学、调节血脂等而改善局部微循环[11-13]。

表2 芹菜素对深II 度烧伤大鼠创面MPD、MVD 和含水量的影响（）

表2 芹菜素对深II 度烧伤大鼠创面MPD、MVD 和含水量的影响（）

注∶假烧伤组、模型组予腹腔注射0.9%氯化钠溶液2mL/kg；磺胺嘧啶银软膏单药组予烧伤皮肤涂抹磺胺嘧啶银软膏并腹腔注射0.9%氯化钠溶液2mL/kg；磺胺嘧啶银软膏+芹菜素低、中、高剂量组予烧伤皮肤涂抹磺胺嘧啶银软膏并分别腹腔注射6.25、12.5、25mg/mL 浓度的芹菜素溶液2mL/kg；MPD 为微循环血流灌注值；MVD 为微血管密度；与假烧伤组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01；与磺胺嘧啶银软膏单药组比较，cP＜0.05，ccP＜0.01

表3 芹菜素对深II 度烧伤大鼠创面组织EGF、VEGF、bFGF 蛋白表达的影响（）

表3 芹菜素对深II 度烧伤大鼠创面组织EGF、VEGF、bFGF 蛋白表达的影响（）

注∶假烧伤组、模型组予腹腔注射0.9%氯化钠溶液2mL/kg；磺胺嘧啶银软膏单药组予烧伤皮肤涂抹磺胺嘧啶银软膏并腹腔注射0.9%氯化钠溶液2mL/kg；磺胺嘧啶银软膏+芹菜素低、中、高剂量组予烧伤皮肤涂抹磺胺嘧啶银软膏并分别腹腔注射6.25、12.5、25mg/mL 浓度的芹菜素溶液2mL/kg；EGF 为表皮生长因子；VEGF 为血管内皮生长因子；bFGF 为碱性成纤维细胞因子；与假烧伤组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01；与磺胺嘧啶银软膏单药组比较，cP＜0.01

按照“三度四分法”分级，根据烧伤深度可分为I度、浅II 度、深II 度和III 度烧伤，其中深II 度烧伤临床最为常见。因此，本研究采用压力0.03MPa、106℃持续5s 的方法制备深II 度烧伤大鼠模型，结合外用磺胺嘧啶银软膏，探讨芹菜素对烧伤创面微循环及创面愈合的影响[14]。结果显示，与磺胺嘧啶银软膏单药组比较，磺胺嘧啶银软膏+芹菜素治疗能够显著改善创面愈合状况、抑制创面组织病变、提高创面愈合率，能够提高创面组织MPD、MVD 并降低创面组织含水量，提示芹菜素能够改善大鼠深II 度烧伤创面局部微循环并促进创面愈合。

在烧伤创面愈合的过程中，多种生长因子促进细胞增殖与分化、合成与分泌创面愈合所需物质而发挥重要作用[15]。EGF 能够促进表皮角质细胞、纤维细胞增殖并促进血管新生和核酸蛋白质合成[16]；bFGF 则能够促进细胞增殖、分化和迁移，并促进表面上皮组织生成[17]；VEGF 特异性作用于血管内皮细胞有丝分裂原，具有较强的促血管新生作用[18]。本研究发现，与磺胺嘧啶银软膏单药组比较，磺胺嘧啶银软膏+芹菜素治疗能够显著上调创面组织EGF、bFGF、VEGF 蛋白表达，这可能是芹菜素促进大鼠深II 度烧伤创面血管新生进而改善创面微循环的重要机制。

综上所述，芹菜素能够通过改善局部微循环而促进大鼠深II 度烧伤创面愈合，其机制可能与调节相关生长因子表达而促进血管新生有关。