白花蛇舌草乙醇提取物逆转肺癌细胞化疗耐药作用研究

李纪鹏 陈丽萍 俞万钧

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，化疗药物多西他赛（docetaxel）已广泛用于肺癌临床一线治疗。然而，化疗耐药大大限制了患者的临床获益[1-3]。研究表明，上皮-间质转化（epithelial to mesenchymal trasnsition，EMT）是导致肿瘤化疗耐药的重要原因，EMT是以上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）的减少或缺失以及间质标志物波形蛋白（vimentin）增多为主要特征，同时伴随多条信号转导通路的激活。白花蛇舌草（Hedyotis diffusa willd，HDW）为茜草科耳草属，研究表明，白花蛇舌草制剂能通过调节细胞周期、诱导凋亡作用相关的信号通路的蛋白表达发挥抗肿瘤效应[4-5]。本研究将利用前期建立的肺癌耐多西他赛细胞系A549/DTX[6]，探讨白花蛇舌草干预其化疗的作用及潜在机制，为抗肿瘤药物选择提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材 料 人肺癌细胞系A549 购自中科院上海细胞库，耐药细胞系A549/DTX 为本实验室构建，能稳定生长于终浓度50μg/L 的多西他赛[6]。多西他赛为北京百灵威科技有限公司产品（批号LE70P68）。白花蛇舌草由医院药房提供（购自华东医药股份有限公司，批号190116）。DMEM 培养基（批号2085250）和胎牛血清（批号2036224C）为美国Gibco公司产品；E-cadherin（批号SC8426）、vimentin（批号SC6260）和PI3K（批号SC1637）、AKT（批号SC5298）及其磷酸化抗体（批号SC52148，SC52940）为美国Santa Cruz 公司产品。细胞培养板和Trans-well 小杯购自Corning 公司。

1.2 细胞培养 A549 和A549/DTX 细胞均用含10%胎牛血清的DMEM 培养基于5%CO2的37℃培养箱中培养。A549/DTX 细胞的培养基中另加入终浓度为50μg/L 的多西他赛。

1.3 白花蛇舌草乙醇提取物（ethanol extract of hedyotis diffusa willd，EEHDW）制备 白花蛇舌草应用95%乙醇进行回流提取，过滤，回收乙醇，将过滤液浓缩至1.05 的相对密度，然后进行真空干燥获得白花蛇舌草粉末提取物。将提取物溶于40% DMSO中，制备成400mg/mL 的溶液备用。使用前用DMEM培养基稀释成2、4、6mg/mL 的浓度。

1.4 细胞IC50 测定 分别取对数生长期的A549、A549/DTX 或2mg/mL EEHDW 处理后的A549/DTX，按照5×103/孔接种于96 孔培养板中，细胞培养过夜后，分别加入梯度稀释的多西他赛，每个浓度设置6个复孔，并设只加细胞不加药的对照孔和只加培养液的调零孔。继续培养48h 后，每孔加10μL CCK-8试剂，继续培养2h。在酶标仪上检测各孔450nm 处的吸光度（A），计算细胞生长抑制率∶生长抑制率（%）=（1-实验孔A 值/对照组A 值）×100%，细胞半数抑制量（IC50）为生长抑制率为50%时的药物浓度。

1.5 集落形成实验 取对数生长期的A59/DTX 细胞，按照每孔1×103个细胞接种于6 孔板，细胞培养过夜后，在各孔中加入终浓度为0（对照组）、2、4 和6mg/mL 的EEHDW，培养约2 周后形成肉眼可见的细胞集落。PBS 清洗3 次，95%的乙醇固定30min，用1%的结晶紫染色10min，经PBS 清洗、晾干后拍照，计算集落形成数，每组设3 个复孔。

1.6 细胞侵袭实验 使用Transwell 分析A549/DTX细胞侵袭能力，首先用50mg/L Matrigel 1:8 稀释液包被Transwell 小室底部膜的上室面，4℃风干。细胞分组及处理同1.4，将5×104个细胞用无血清培养基重悬接种于上室中，下室为含10%胎牛血清的培养基，37℃孵育48h 后，棉球擦拭上室细胞，将小室置于95%的乙醇固定30min，用1%的结晶紫染色10min，经PBS 清洗，显微镜下计数穿透Transwell 膜的细胞数，实验重复3 次。

1.7 Western blot 法检测蛋白表达 收集细胞，运用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，经10%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，将膜置于含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液中，37℃封闭2h。分别加入抗E-cadherin、vimentin、PI3K、AKt 及其磷酸化抗体，在4℃下孵育过夜。1×TBST 缓冲液洗膜，加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，置于37℃孵育2h。1×BST 缓冲液洗膜，采用化学发光法检测目的蛋白条带。以βactin 作为内参照。

1.8 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，数据采用3 次以上独立实验结果的均数±标准差（） 表示，单因素方差分析比较组间差异，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多西他赛耐药的A549/DTX 细胞发生EMT在倒置显微镜下观察细胞形态，与A549 细胞比较，多西他赛耐药的A549/DTX 成纤维样细胞形态改变。Western blot 检测EMT 相关标志物。结果显示，上皮标志物E-cadherin 在A549/DTX 表达显著降低，而间质标志物vimentin 表达升高（P 均＜0.05）。这些结果表明多西他赛耐药的A549/DTX 细胞发生EMT，见表1、插页图1。

表1 EMT 相关蛋白表达灰度值比较（）

表1 EMT 相关蛋白表达灰度值比较（）

注∶E-cadherin 为E-钙黏蛋白；vimentin 为波形蛋白；β-actin 为内参蛋白；EMT 为上皮间质转化；与A549 细胞比较，aP＜0.05

2.2 EEHDW 抑制A549/DTX 细胞增殖 利用集落形成实验评估EEHDW 对A549/DTX 细胞增殖能力的影响。结果显示，与对照组比较，随着EEHDW 浓度的增加，A549/DTX 细胞集落形成的数量逐渐减少（P＜0.05），见表2、插页图2。

表2 不同浓度EEHDW 对A549/DTX 细胞增殖能力的影响（）

表2 不同浓度EEHDW 对A549/DTX 细胞增殖能力的影响（）

注∶EEHDW 为白花蛇舌草乙醇提取物；与对照组比较，aP＜0.05

2.3 EEHDW 抑制A549/DTX 细胞侵袭 利用Transwell 实验评估EEHDW 对A549/DTX 细胞侵袭能力的影响。结果显示，与对照组比较，随着EEHDW 浓度的增加，A549/DTX 细胞侵袭数逐渐减少（P＜0.05），见表3、插页图3。

表3 不同浓度EEHDW 对A549/DTX 细胞侵袭能力的影响（）

表3 不同浓度EEHDW 对A549/DTX 细胞侵袭能力的影响（）

注∶EEHDW 为白花蛇舌草乙醇提取物；与对照组比较，aP＜0.05

2.4 EEHDW 逆转A549/DTX 细胞EMT 和化疗耐药 由上述实验可知，三种不同浓度的EEHDW 均能有效抑制A549/DTX 细胞增殖和侵袭，为降低药物对细胞的损伤，我们选择2mg/mL 作为实验浓度，探讨EEHDW 对A549/DTX 细胞EMT 及化疗敏感性的影响。结果显示，EEHDW 能够上调A549/DTX 细胞E-cadherin 蛋白表达，而vimentin 表达水平则受到抑制（见表4、插页图4）。EEHDW 处理后A549/DTX 细胞对多西他赛的IC50 显著降低，但仍高于亲本A549 细胞的IC50，表明EEHDW 能够部分逆转A549/DTX 的耐药性，见表5。

表4 EEHDW 对EMT 相关蛋白表达灰度值比较（）

表4 EEHDW 对EMT 相关蛋白表达灰度值比较（）

注∶EEHDW 为白花蛇舌草乙醇提取物；EMT 为上皮间质转化；E-cadherin 为E-钙黏蛋白；vimentin 为波形蛋白；β-actin 为内参蛋白；与对照组比较，aP＜0.05

表5 各组细胞对多西他赛化疗敏感性比较（）

表5 各组细胞对多西他赛化疗敏感性比较（）

注∶IC50 为细胞半数抑制量；EEHDW 为白花蛇舌草乙醇提取物；与A549 比较，aP＜0.05；与A549/DTX 比较，bP＜0.05

2.5 EEHDW 抑制PI3K/Akt 信号通路 检测化疗诱导EMT 相关的信号通路结果2mg/mL EEHDW 处理A549/DTX 细胞后，磷酸化的PI3K（p-PI3K）和AKt（p-AKt）的表达显著降低（P＜0.05），而PI3K 和AKt总蛋白的表达无明显变化。提示EEHDW 可能是通过PI3K/Akt 信号通路逆转A549/DTX 细胞EMT，见表6、插页图5。

3 讨论

白花蛇舌草为茜草科耳草属，其性寒，味苦、甘，归胃、大肠、小肠经，具有清热解毒、消炎止痛、利尿消肿的功效。研究表明，白花蛇舌草制剂对多种肿瘤细胞具有明确的体外抑制增殖作用，其可能作用机制是调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax 表达水平，实现Bcl-2/Bax 比例下调诱导肿瘤细胞凋亡[7-8]。最近报道，白花蛇舌草制剂能够通过下调MMP-2 和MMP-9 表达抑制肿瘤转移[9]。本研究结果显示，白花蛇舌草干预肺癌化疗耐药的机制可能与EMT 相关。

表6 PI3K/Akt 信号通路蛋白表达灰度值比较（）

表6 PI3K/Akt 信号通路蛋白表达灰度值比较（）

注∶EEHDW 为白花蛇舌草乙醇提取物；p-PI3K 为磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶；PI3K 为磷脂酰肌醇3-激酶；p-AKt 为磷酸化蛋白激酶B；AKt为蛋白激酶B；β-actin 为内参蛋白；与对照组比较，aP＜0.05

既往在卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌等方面的研究表明，化疗耐药的癌细胞表现出EMT 的生物学过程特征，上皮细胞失去细胞间的接触，发展成间充质细胞特性，其特征是细胞形态改变，移动能力增强，上皮细胞标志物E-cadherin 蛋白的下调和间质细胞标志物vimentin、N-钙黏蛋白和纤维粘连蛋白的上调[10-12]。因此，控制化疗诱导的EMT 对于开发克服耐药性的新治疗策略至关重要。本研究结果显示，多西他赛耐药的A549/DTX 呈现纤维样细胞形态改变，同时EMT 相关标志蛋白E-cadherin 表达下调，Vimentin 表达上调，表明A549/DTX 发生EMT。进一步研究发现白花蛇舌草能够抑制A549/DTX 细胞的增殖和侵袭，促进E-cadherin 而抑制Vimentin 的表达，使A549/DTX 向上皮特性细胞转变。

文献报道，复杂的EMT 过程与PI3K/Akt 信号通路有关[13-14]，PI3K/Akt 信号通路也参与包括肺癌在内的许多癌细胞的多西他赛耐药[15-17]。然而，尚不清楚白花蛇舌草是否通过调控PI3K/Akt 信号通路参与肺癌化疗诱导的EMT 过程。为了验证这一设想，我们用EEHDW 处理A549/DTX 后发现磷酸化的PI3K和Akt 均显著下调而其总蛋白无明显变化，表明EEHDW 能够抑制PI3K/Akt 信号通路。提示EEHDW是通过PI3K/Akt 参与多西他赛诱导的EMT。

综上所述，EEHDW 能够抑制多西他赛耐药的A549/DTX 细胞增殖、侵袭，部分逆转化疗诱导的EMT 和化疗耐药，其机制可能是通过调控PI3K/Akt信号通路实现。