抚顺地区猪链球菌病病原分离和鉴定

杨春艳

（抚顺市农业特产学校，辽宁 抚顺 113123）

猪链球菌的血清型有35 个，还有一些菌株的血清型没有被定型[1-2]。其中，猪链球菌2 型和1型，是猪的重要致病菌，可感染给人，是集约化养猪场的常见病，是严重危害养猪业的细菌性传染病[3-4]。为了检出抚顺地区猪链球菌病流行菌株的血清类型、耐药性等特点，方便临床更好的采取预防措施。

本研究应用传统的实验室检验方法，在抚顺地区发生猪链球菌病的31 个乡镇，采取典型发病猪的病料，进行了分离培养、血清型鉴定、药敏试验、毒力测定试验，为该病的防治提供有力的数据资料。

1 材料与方法

1.1 病料来源

抚顺地区不同猪场发生典型猪链球菌病的20头死亡猪，在无菌条件下采取病猪心、脾、肝、淋巴结、关节液等组织样本，共30份。

1.2 主要试剂

HM47 链球菌乳胶凝集标准诊断试剂盒，广东环凯微生物科技有限公司生产。参考菌株ATCC35246，马腺疫链球菌兽疫亚种，链球菌C群，2 型猪链球菌标准菌株，购自中国药品生物制品鉴定所，其余菌株自行分离。070200 猪链球菌生化鉴定盒，广东环凯微生物科技有限公司生产。

1.3 试验动物

ICR 小鼠40 只，规格：20～25 g·只-1，购自锦州医科大学实验动物中心

2 试验方法

2.1 细菌形态学观察

采取病猪心，脾、肝、淋巴结30 份。进行涂片、革兰氏染色、镜检，观察结果。

2.2 病原菌的分离

将病料接种在普通培养基上和血液平板上，37 ℃，24 h 培养后，挑取可疑菌落，革兰氏染色，镜检。镜检后如果看到成链状排列的G+菌，将可疑菌落接种在血平板上做纯培养后，观察。将纯培养的菌落接种在血清马丁肉汤中增菌培养，37 ℃培养24 h，观察其生长表现。然后接种血清肉汤纯化后，4 ℃冷藏备用。

2.3 生化实验

猪链球菌生化鉴定盒使用方法：从血琼脂平板上挑取可疑的溶血性菌落，放在0.85%生理盐水中，与0.5 McFarlang比浊管进行比浊，将细菌悬液体制备成0.5 McFarlang，备用。再用一次性吸管吸取2滴制备好的菌悬液体，分别加入到微量生化管中，盖上西林瓶塞子，置于瓶架上，37 ℃恒温箱中培养后，观察结果。

2.4 血清分型

乳胶凝集实验过程：所有的试剂在使用前要达到室温。用10 mL 蒸馏水把酶试剂溶解后，将酶提取液分装于试管中，每管0.4 mL。用灭菌接种环挑取实验室分离的菌株加入到酶溶液中，制成菌悬液。将试管置于37 ℃水浴锅中10～15 min，使菌液混合均匀。乳胶试剂充分摇匀，分别滴入6个反应环内1滴。如果存在对应型的链球菌会出现肉眼可见的颗粒凝集，为阳性。如果乳胶试剂仍然光滑，说明是阴性，无凝集或者凝集微弱。同时做AG群阳性对照、生理盐水空白对照和ATCD35246对照。

2.5 动物致病性实验

将40 只试验小鼠（体重20～25 g）分为试验组36只，共9组，每组4只，对照组4只小鼠。9株分离菌株在血清肉汤中培养12 h，取其培养物，经过离心，吸取菌体，试验组每只小鼠注射0.2 mL。对照组每只小鼠腹腔注射0.2 mL 血清肉汤。注射后小鼠隔离饲养，记录其发病情况。死亡小鼠立即解剖，取死亡小鼠的肝脏涂片、革兰氏染色，镜检。同时要在血液琼脂平板上做分离培养。

2.6 药敏实验

将菌株在马丁琼脂斜面培养基上接种，培养24 h，做含菌数为1.5×106个·mL-1的稀释，用灭菌棉签蘸取稀释液在平板上均匀涂抹，盖盖放置5 min，用镊子将药敏片放在平板上轻压实，每个平板上放3 个药敏片，每个药敏片距离25 mm，纸片和平板边缘不小于15 mm，37 ℃18 h后观察[5]。

3 试验结果

3.1 细菌形态学观察结果

病料经过革兰氏染色，阳性，病料中多为圆形或椭圆形的单个散在或成双排列，少数是链状出现的球菌，在血液平板上和肉汤培养基中的菌落，镜检可以看到8～15个球菌链。

3.2 细菌分离培养结果

本细菌在有氧和无氧的条件下均能生长繁殖，在普通培养基上不爱生长。在含有葡萄糖、血液的培养基中生长很好，可以见到露珠样的菌落，边缘整齐，光滑黏稠，有α或者是β溶血环。在马丁肉汤中，底部有沉淀。在血清肉汤中，先使肉汤混浊，后在试管底部有颗粒沉淀，无菌膜，上清液透明。

3.3 生化实验结果

在37 ℃条件下能够生长，在10 ℃、15 ℃条件下不能生长。在40%和10%胆汁管中，呈阳性。过氧化氢酶试验阴性。淀粉水解试验（+）。甘油试验（-）。水解七叶苷（+）。能够发酵葡萄糖、麦芽糖等糖，能够产酸。能多数发酵甘露醇等糖，少数不发酵，产酸，不能产生靛基质。V-P 试验阴性，甲基红试验（M.R）阳性。试验结果均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的细菌为猪链球菌。

3.4 细菌血清分型结果

猪链球菌血清型检验结果见表1。乳胶凝集试验结果：分离菌株与诊断液反应结果为阴性，ATCD35246 与C 群诊断液反应为阳性，A-G 群抗原对照为阳性。玻片凝集试验结果：分离菌株与2型血清呈阳性反应，ATCC35246 为阴性。血清试验结果为病料的病原属于R群猪链球菌2型。

3.5 动物致病性试验结果

致病性试验结果见表2。腹腔接种分离菌株的小鼠5 h 后开始死亡，15 h 全部死亡。死后剖检可见胸腔充满积液，膀胱充血，肝、肾、脾水肿，心脏血液和胸腔积液涂片，革兰氏染色后，显微镜下观察可见散在的或成链状的G+球菌。对照组没有任何异常。采取死亡小鼠的肝、肺等发病组织进行细菌分离培养鉴定，分离菌株的培养特性和生化试验结果与供毒细菌一致。

表2 致病性试验结果

3.6 药敏实验结果

分离菌株对氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、头孢噻吩、头孢拉啶、克林霉素、氟甲砜霉素、强力霉素高敏。罗红霉素、氯霉素、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星中度敏感。庆大霉素、新霉素、青霉素不敏感。

4 讨 论

猪链球菌2 型的死亡率和感染率都比较高，为了能更快的控制猪链球菌2型引起的感染，从病死猪病料中分离鉴定出猪链球菌2型，是临床诊治的重要病原学依据。从药敏实验结果看，平时认为比较高效的药物其敏感性却很低，多表现耐药，很多地区药敏试验结果都有较大的差异，这和临床上滥用抗生素有极大的关系。所以对于猪链球菌病的治疗，早期可以联合用药，最好在药敏试验的基础上再选用敏感性较高的药物治疗。采取综合防治措施，加强饲养管理，适当的对症治疗[6]。

5 小 结

本研究从抚顺地区的养猪场中收集患有猪链球菌病的组织病料，通过分离培养得到9 株细菌株，生化实验确定这些菌株和猪链球菌性质相似，血清型实验证明了只有1 个血清型：2 型。小鼠致病性实验表明，这些菌株致病型强，死亡率为100%。药敏实验中，抚顺地区分离的猪链球菌对氟甲砜霉素最为敏感，可以作为治疗猪链球菌病的药物。另外，分离菌株对氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、头孢噻吩、头孢拉啶、克林霉素、强力霉素高敏。在实际临床中考虑到用药成本，采取综合治疗措施，在使用疫苗的基础上，发病猪只用少量的敏感药物作为辅助治疗，同时加强饲养管理，对链球菌病的防治能取得比较好的效果。