荧光定量检测试纸检测饲料中黄曲霉毒素B1

王 虎

（辽宁省农业发展服务中心，沈阳 110032）

黄曲霉毒素B1（AFB1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）。AFB1是已知的化学物质中致癌性最强的一种。AFB1对包括人和若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害[1-4]。目前，可用液相色谱法检测黄曲霉毒素B1，但需要大型的仪器设备，价格昂贵，操过过程复杂、时间长，且无法在现场和基础小型实验室使用[5-7]。也有采用黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒用于大量样品的筛查，检测快速，但操作复杂[8-9]。因此，急需一种既简单快速，又能准确定量的检测方法，荧光定量免疫层析技术正好可以满足需求[10]。本试验拟建立一种饲料中黄曲霉毒素B1荧光定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

荧光免疫分析仪（苏州和迈精密仪器有限公司），XH-C 涡旋混合器（新宝仪器有限公司），称量天平（DIGITAL SCALE）。

1.1.2 主要试剂和耗材

黄曲霉毒素B1单克隆抗体和黄曲霉毒素B1半抗原-牛血清白蛋白偶联物，购自武汉优博生物技术有限公司；MES，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；EDC，购自国药集团；试剂牛血清白蛋白，购自上海生工生物工程有限公司；时间分辨荧光微球，购自上海辉质生物科技有限公司；黄曲霉毒素B1及其他真菌毒素的标准品，购自Sigma公司；硝酸纤维素膜，购自MDI。

1.2 溶液的配制

0.1 M 磷酸氢二钠：Na2HPO4·12H2O 35.85 g·L-1，纯化水溶解。微球洗涤液：MES 1.95 g·L-1，纯化水溶解，1 mol·L-1NaOH 调节pH 至6.0。微球活化剂：EDC 76.68 g·L-1，纯化水溶解，置于4 ℃保存。0.05 mol·L-1BB 9.0：十水合硼砂3.814 g·L-1，硼酸0.619 g·L-1，纯化水定容至1 L 即可。微球封闭液1：牛血清白蛋白100 g·L-1，纯化水溶解后置于4 ℃保存。微球封闭液2：甘氨酸75.07 g·L-1，溶解后置于4 ℃保存。标记复溶液：蔗糖100 g·L-1，海藻糖100 g·L-1，牛血清白蛋白20 g·L-1，PEG20000 5 g·L-1，PVP-K30 5 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 17 g·L-1，NaH2PO4·2H2O 0.414 g·L-1，溶解后加入PC300 3 mL，置于4 ℃保存。样品垫处理液：Na2HPO4·12H2O 17 g·L-1，NaH2PO4·2H2O 0.414 g·L-1，蔗糖5 g·L-1，PEG20000 5 g·L-1，PVPk-30 5 g·L-1，柠檬酸三钠3 g·L-1，PEG6000 1 g·L-1，casein 3 g·L-1，S9 1 g·L-1，S17 1 g·L-1，S21 1 g·L-1，Tween20 20 mL g·L-1。待以上试剂完全溶解，将玻璃纤维素膜浸湿，之后37 ℃干燥8～10 h 后，待用。样品稀释液：称取NaCl 80 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.44 g 和KH2PO40.24 g溶于800 mL 蒸馏水中，用pH 计测得溶液的pH 为7.4±0.2，然后再加P-300 300 μL，最后加纯化水定容至1 L。样品提取液：称取Na2HPO4·12H2O 2.035 g和Na2HPO4·2H2O 0.050 g，用50 mL 纯 化 水 全 部溶解后，再加甲醇700 mL，最后用纯化水定容至1 L。

1.3 试验方法

1.3.1 样本处理方法

称取研碎的样本2.0±0.05 g 置于50 mL 离心管中，加入10 mL 样本提取液，用振荡器充分振荡5 min，将振荡后的样本用定量分析滤纸过滤，用样本稀释液将滤液按1：7比例稀释，取稀释后液体进行检测（稀释系数40）。

1.3.2 操作步骤

打开荧光免疫分析仪，同时撕开检测试纸铝箔袋，取出检测试纸，放于平整、洁净的台面上用配套吸管吸取待检样本，垂直而缓慢的滴加2～3滴（约60 μL）到加样孔内。静置10 min，上机检测。

荧光免疫分析仪操作：轻按开机键开机——点击“系统设置”——点击“检测项目管理”——选择需检测的项目（黄曲霉毒素B1）——将检测试纸插入检测孔内——点击“快速测试”，开始检测检测下一个样本，点击“新测试”——点击“快速检测”即可。当检测结果＞80 μg·kg-1时，可用样本稀释液将上述检测液稀释5倍后再进行检测，所得读数值乘以对应的稀释倍数即为最终的检验结果。

2 结果与分析

2.1 包被量的确定

用0.1 mol·L-1Na2HPO4将包被抗原（7 mg·mL-1）按 照0.21、 0.28 mg·mL-1和 划 膜0.35 mg·mL-1，37 ℃干燥待用，与结合垫、样品垫进行配对。结果显示，选用0.28 mg·mL-1包被时，梯度添加标准品，灵敏度最高，结果见表1。

表1 不同包被量对检测结果（T/C）的影响

2.2 标记量的确定

2.2.1 微球清洗

50 μL 荧光微球加入1 mL 0.01 mol·L-1MES 缓冲液中，混匀，12 000 r·min-1离心15 min；弃上清，加入0.01 mol·L-1MES 缓冲液1 mL，混匀离心；重复上述步骤3 次，并用0.01 mol·L-1MES 缓冲液1 mL 复溶。

2.2.2 微球活化

向清洗后微球加入250 μL·mL-1EDC 缓冲液，混匀，室温避光反应30 min；12 000 r·min-1离心15 min，弃 上 清，加 入0.01 mol·L-1MES 缓 冲 液1 mL，混匀，2 000 r·min-1离心15 min。

2.2.3 微球标记

弃上清，用0.05 mol·L-1PB9.0 4 mL 进行复溶，均分至4 管分别加入0.3、0.4、0.5 μL 标记抗体（4.7 mg·mL-1），室温避光反应30 min。

2.2.4 微球封闭

各加入100 μL 1 mol·L-1甘氨酸溶液混匀，室温避光反应15 min；再各加入100 μL 10%BSA 溶液混匀，室温避光反应15 min；12 000 r·min-1离心15 min。

2.2.5 微球复溶

将离心后微球用复溶液复溶后，按照3 μL·cm-1喷量喷出。

2.2.6 微球标记浓度检测

与包被膜、样品垫组合检测结果显示，标记抗体浓度是0.4 μL·mL-1时，梯度添加标准品，灵敏度最高，结果见表2。由表2 可知，最佳标记量是0.4 μL·mL-1。

表2 包被膜与标记抗体配对检测结果

2.3 检测结果分析

2.3.1 线性范围与检出限

取6个无污染（阴性）精料样品和6个无污染（阴性）玉米样品，分别添加黄曲霉毒素B1标准品0、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 μg·kg-1，用黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条每个样品检测3次，以添加浓度为为纵坐标，以荧光定量检测试纸条的检测结果为横坐标，拟合曲线并计算线性相关系数，见图1。

计算得出粮食谷物的线性范围：5～80 μg·kg-1，回归方程：y=1.03x-0.15，相关系数r2=0.998。

2.3.2 准确性和重复性分析

在用GB/T 17480-2008 饲料中黄曲霉毒素B1的测定酶联免疫吸附法测定为0的不同种类空白样品中分别添加黄曲霉毒素B1浓度为0、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 μg·kg-1的标准品，然后按照黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条的检测方法进行检测。检测结果见表3。

图1 黄曲霉毒素B1标准品添加与荧光定量试纸条检测值的线性关系

表3 不同样本检测的准确性和重复性

从表1可以看出，黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条测试不同粮食谷物中黄曲霉毒素B1的添加回收率在92.7%～105%，3 次重复的变异系数＜14.4%。

2.3.3 与ELISA方法的对比试验结果

取玉米粉、高粱、棉籽、甜菜粕、青贮玉米受污染样品各1 份，先采用ELISA 法进行测定，再使用黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条进行测定，检测结果见表4。

表4 黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸与ELISA检测值对比

由表4 可知，在不同的粮食谷物饲料中，黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸与ELISA 的符合率为99.66%～111.87%，3 次重复的变异系数在13.68%以内。

2.4 方法特异性

选择其他5 种常见的真菌毒素的标准品在阴性玉米中进行添加，添加的浓度为1 000 μg·kg-1，然后用黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条进行测试，每个样品测3 次取平均值结果见表5。由表5 可知，与赭曲霉毒素A、伏马菌素B1、呕吐毒素、T-2 毒素、玉米赤霉烯酮毒素的交叉反应率均＜5%。试验结果表明，黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条对赭曲霉毒素A、伏马菌素B1、呕吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮毒素几乎无交叉反应，其方法特异性可以满足检测要求。

表5 交叉反应率

3 结 论

本研究研发了一种黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条，通过对不同的粮食谷物饲料样本进行测试，该产品的最低检出限为5 μg·kg-1，线性范围为5～80 μg·kg-1，线性范围内的添加回收率为92.7%～111.87%，变异系数＜14.4%。与其他真菌毒素的交叉反应率均＜5%。其准确性和可靠性可以满足我国对黄曲霉毒素B1的分析标准的技术要求。该方法具有简单快速、准确可靠、重复性好等特点，可用于不同粮食谷物饲料中黄曲霉毒素B1的快速定量检测分析。