肝脏p38MAPK/NF-κB 通路在大鼠烧伤休克期切痂以减轻炎症反应中的作用

段建兴 刘文军 曾跃勤 张高飞 王 迪 李佳美 娄涵潇

（1.昆明医科大学第二附属医院烧伤科，云南 昆明 650500；2.昆明医科大学分子临床医学研究院，云南 昆明 650500）

大面积深度烧伤创面中的组织变性和坏死是烧伤后全身严重炎症反应的始动因素，烧伤后由于皮肤屏障的破坏导致感染的侵袭及应激性反应可持续活化全身炎症反应系统，造成患者多器官功能衰竭[1]。研究表明休克期切痂能够减轻氧自由基的损伤，纠正血流动力学紊乱，减少炎症因子的产生，控制及减轻感染的发生[2]，故及早进行创面切痂手术能够减少烧伤患者的炎症因子活化。研究显示，肝脏与严重烧伤后全身炎症因子的产生有重要关系，肝脏中含有人体内最大的固有巨噬细胞群——库普弗细胞群（Kupffer cells），当机体遭受严重烧伤后脂多糖等有害因子可直接刺激活化该细胞群，释放大量的炎症因子[3-4]，且该过程与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路密切相关[5]。因此肝脏可能是严重烧伤后患者出现全身炎症联级反应的主要起发点。热力损伤后的组织细胞可释放大量的炎症介质[6]。这些炎症介质通过活化肝脏MAPK 通路可释放大量的炎症因子，早期切痂封闭创面理论上能够从源头上减少这些炎症介质的释放从而减少炎症因子的产生，但具体机制还不明了。本研究通过观察休克期切痂后体循环血清炎症因子的改变，并探讨烧伤后炎症因子的主要释放器官肝脏中炎症信号通路p38MAPK/核转录因子-κB（NF-κB）的表达变化，旨在为烧伤后适宜休克期切痂进一步提供理论依据。

1 材料及方法

1.1 动物模型复制、分组与处理方法 雄性SPF 级SD 大鼠68 只作为受体实验动物，体质量230 ～250 g（其中3 只实验过程中死亡）。雄性SPF 级Wistar 大鼠23 只作为异体皮供体，体质量230 ～250 g，术前禁食12 h、禁水4 h。异体皮的制备：Wistar 大鼠用3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，背部剃毛，用Veet 脱毛膏再次脱毛，消毒后用手术刀切取全层皮肤，面积约25%TBSA，切下来的皮肤修去多余的筋膜，0.5%碘伏中浸泡5 min，无菌生理盐水冲洗备用。SD 大鼠随机分为模型组、切痂组、假手术组。模型组：将大鼠麻醉，背颈部同样方法脱毛后浸入98 ℃水浴锅中10 s 造成30% TBSA Ⅲ度烧伤，伤后立即腹腔注射生理盐水（50 ml/kg）补液抗休克。切痂组：大鼠处理方法同模型组，烫伤后12 h行切痂手术并使用异体皮缝合覆盖。假手术组：大鼠脱毛后浸入37 ℃水浴锅中10 s，并腹腔注射生理盐水（50 ml/kg）模拟抗休克，12 h 后模拟切痂手术及自体皮覆盖缝合。模型组分别在烫伤后12、24、48、72、96 h 取材，切痂组和假手术组分别在烫伤后24、48、72、96 h 取材，每个时相点5 只。

1.2 标本收集 SD 大鼠于各个观察时相点麻醉后断头处死取血，收集新鲜血液约2 ml，室温静置30 min，待血液分层后4℃、8 000 r/min 离心10 min，吸取上层血清分装，-80 ℃保存，取血的同时立即切取部分肝脏，-80 ℃保存待检。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清炎症因子—内毒素结合蛋白(LBP)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-10 试剂盒分别由武汉云克隆科技股份有限公司、杭州联科生物技术股份有限公司提供，按照试剂盒说明书进行，按照特定波长使用SpectraMax M2 检测每孔吸光度，根据标准品的浓度对每孔各炎症因子进行定量分析。

1.3.2 Western blot 检测大鼠肝脏p38MAPK/NF-κB 通路表达蛋白 取冻存的肝脏组织30 mg放入玻璃匀浆器中，加入200 μl 强裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）及磷酸酶抑制剂A、B 液各8 μl（赛维尔公司提供），匀浆后冰上放置10 min，4 ℃超高速离心机10 000 r/min 离心10 min 后取部分中间液体，利用BCA 蛋白浓度测定试剂盒（赛维尔公司提供）检测蛋白浓度并计算上样体积，按4 ∶1 的比例加入蛋白上样缓冲液（还原型）混匀后放入金属水浴锅中，100 ℃煮5 min 进行蛋白变性，于-80 ℃冰箱中保存备用。配制分离胶及压缩胶加入电泳液，每个胶孔分别加入Marker 及样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕，根据目的蛋白及内参的相对分子质量切取相应的凝胶，再将凝胶上的目的蛋白进行湿转到聚偏氟乙烯（PVDF）上，使用含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST 封闭2 h，用含兔源一抗p38 MAPK(1:1 000)、磷酸化p38 MAPK （p-p38 MAPK）Thr180/Tyr182（1:1 000）、磷酸化-NF-κB（p-NF-κB） p65 Ser536（1:1 000）的2% BSA（TBST 配制）进行孵育，4 ℃过夜，取出PVDF膜，使用TBST 放在摇床上洗涤5 min，共洗5次，再使用二抗抗兔IgG-HRP-抗体（1:2 000）室温摇床上孵育1 h（以上一抗及二抗均由Cell Signaling Technology 提供），用上述方法再次用TBST 洗涤，取出PVDF 膜，将HRP 化学发光显色液均匀地涂在 PVDF 膜上，使用Bio-rad伯乐凝胶成像仪进行化学发光成像，成像后使用Image J 进行灰度值分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析，计量数据以表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用配对t 检验，P＜0.05 代表差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清LBP 水平的变化 LBP 在大鼠模型组各时相点与烫伤后12 h 比较均升高，在48 h 时到达峰值且差异有显著性（P＜0.05），之后逐渐平稳。切痂组在同一时相点与模型组比较，LBP 表达48 h 时下降最多，差异具有显著性（P＜0.05），但其余时相点差异没有显著性（P＞0.05）；组内各时相点比较差异也没有显著性（P＞0.05）。假手术组中各时相点LBP 表达均比模型组少，在48 h 及96 h时相点比较差异具有显著性（P＜0.05）；但与切痂组相同时相点比较及组内各时相点间比较，差异均无显著性（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠伤后不同时间血清LBP 水平的比较(，n=5，ng/ml)

表1 各组大鼠伤后不同时间血清LBP 水平的比较(，n=5，ng/ml)

注：与本组伤后12 h 比较：*P＜0.05；与本组伤后24 h 比较：#P＜0.05；与模型组相同时相点比较：Δ P＜0.05

组别 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h模型组 1.49±0.57 2.38±0.64 2.72±0.80*# 2.05±0.50 1.83±0.47切痂组 - 2.10±0.67 1.69±0.55Δ 1.89±0.37 1.78±0.34假手术组 - 1.79±0.35 1.70±0.29Δ 1.49±0.53 1.34±1.65Δ

2.2 血清HMGB1 水平的比较 模型组各时相点与烫伤后12 h 比较HMGB1 均升高，72 和96 h时差异有显著性（P＜0.05 和P＜0.01），96 h 达峰值。与模型组同一时相点比较，切痂组HMGB1 表达在各个时相点均下降（P＜0.01）；组内各时相点之间无明显变化（P＞0.05）。假手术组各时相点HMGB1 表达明显减少（P＜0.01），组内各时相点间比较差异亦无显著性（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠伤后不同时间血清HMGB1 水平的比较(，n=5，pg/ml)

表2 各组大鼠伤后不同时间血清HMGB1 水平的比较(，n=5，pg/ml)

注：与本组伤后12 h 比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与本组伤后24 h 比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相同时相点比较：ΔΔ P＜0.01；与切痂组相同时相点比较：ΟΟP＜0.01

组别 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h模型组 69.26±3.45 71.80±5.47 70.47±3.11 82.07±7.59*# 87.43±6.66**##切痂组 - 48.74±10.38ΔΔ 52.36±9.51ΔΔ 48.82±4.80ΔΔ 42.91±8.27ΔΔ假手术组 - 22.04±10.50ΔΔΟΟ 18.70±8.78ΔΔΟΟ 24.07±6.37ΔΔΟΟ 18.39±8.25ΔΔΟΟ

2.3 血清IL-6 水平的比较 IL-6 水平在模型组伤后12 h到达峰值，96 h时较12 h明显下降（P＜0.01）。切痂组在相同时相点与模型组比较，IL-6 均下降，在48、72、96 h 差异均具有显著性（P＜0.05 或P＜0.01）；组内比较，伤后72 h 及96 h 较24 h 表达明显减少（P＜0.05）。假手术组各时相点IL-6表达均较模型组及切痂组明显减少（P＜0.01）；组内比较，伤后72 h 明显减少（P＜0.01）。见表3。

2.4 血清TNF-α 水平的比较 TNF-α 水平在模型组24 h 到达峰值之后逐渐减少，96 h 时较12 h 明显减少（P＜0.05）。同一时相点切痂组与模型组比较，TNF-α 均显著减少（P＜0.01）；组内比较,96 h 较24 h 明显减少（P＜0.05）。假手术组各时相点TNF-α 表达均比模型组明显减少（P＜0.01）；而与切痂组比较，48 h 差异有显著性（P＜0.05）；组内比较差异均无显著性（P＞0.05）。见表4。

表3 各组大鼠伤后不同时间血清IL-6 水平的比较(，n=5，pg/ml)

表3 各组大鼠伤后不同时间血清IL-6 水平的比较(，n=5，pg/ml)

注：与本组伤后12 h 比较：**P＜0.01；与本组伤后24 h 比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相同时相点比较：Δ P＜0.05，ΔΔ P＜0.01；与切痂组相同时相点比较：ΟΟP＜0.01

组别 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h模型组 207.03±16.53 201.97±17.55 184.16±15.30 170.37±37.52 148.87±25.45**##切痂组 - 174.95±34.07 130.41±36.51ΔΔ 123.22±26.91Δ# 193.12±17.56ΔΔ#假手术组 - 196.15±16.62ΔΔΟΟ 175.69±24.34ΔΔΟΟ 161.64±9.56ΔΔ##ΟΟ 175.08±22.67ΔΔΟΟ

表4 各组大鼠伤后不同时间血清TNF-α 水平的比较(，n=5，pg/ml)

表4 各组大鼠伤后不同时间血清TNF-α 水平的比较(，n=5，pg/ml)

注：与本组伤后12 h 比较：*P＜0.05；与本组伤后24 h 比较：#P＜0.05；与模型组相同时相点比较：ΔΔ P＜0.01；与切痂组相同时相点比较：ΟP＜0.05

组别 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h模型组 116.22±5.98 123.12±7.31 122.22±7.39 113.95±9.25 102.59±7.10*#切痂组 - 181.61±8.62ΔΔ 178.27±4.35ΔΔ 174.67±5.67ΔΔ 168.06±4.60ΔΔ#假手术组 - 175.51±5.22ΔΔ 170.49±3.75ΔΔΟ 172.31±3.79ΔΔ 171.13±4.21ΔΔ

2.5 血清IL-10 水平的比较 IL-10 水平在模型组24 h 到达峰值之后有所减少，但在72 h 及96 h 的水平仍高于12 h（P＜0.05 或P＜0.01）。切痂组在同一时相点与模型组比较，除24 h 外，其余时相点均显著减少（P＜0.01）；组内比较，72 h及96 h 均较24 h 减少（P＜0.05）。假手术组各时相点IL-10 表达均比模型组明显减少（P＜0.05或P＜0.01），而与切痂组比较，除了96 h，其余各时相点均显著减少（P＜0.05）；组内比较，只有72 h 表达较24 h 显著减少（P＜0.05）。见表5。

表5 各组大鼠伤后不同时间血清IL-10 水平的比较(，n=5，pg/ml)

表5 各组大鼠伤后不同时间血清IL-10 水平的比较(，n=5，pg/ml)

注：与本组伤后12 h 比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与本组伤后24 h 比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相同时相点比较：ΔΔ P＜0.01；与切痂组相同时相点比较：ΟΟP＜0.01

组别 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h模型组 35.90±6.62 55.11±13.09 51.95±7.65 52.68±7.63## 53.75±11.80#切痂组 - 55.76±13.07 37.33±9.89ΔΔ 37.77±8.55ΔΔ# 36.08±6.07ΔΔ#假手术组 - 34.57±6.00ΔΟ 25.63±3.78ΔΔΟ 25.58±3.03ΔΔ#Ο 25.59±2.90ΔΔ

2.6 肝脏p38MAPK 蛋白表达的比较 模型组组内比较，大鼠肝脏p38MAPK 总水平差异无显著性。切痂组与模型组比较差异没有显著性；组内比较，切痂组p38MAPK 总水平在96 h 较24 h 显著减少（P＜0.01）。假手术组与另两组相同时相点比较，差异无显著性；组内比较也无显著变化，见图1。

2.7 肝脏p-p38MAPK 蛋白表达的比较 大鼠肝脏磷酸化p-p38MAPK 的表达在模型组中12 h表达最高，96 h 时较12 h 明显减少（P＜0.05）。切痂组在同一时相点与模型组组间比较，各时相点p-p38 MAPK 的表达均显著减少（P＜0.05 或（P＜0.01）；组内比较，96 h 较24 h 明显减少（P＜0.05）。假手术组各时相点p-p38MAPK 的表达均比模型组及切痂组表达明显减少（P＜0.05 或P＜0.01）；组内比较差异无显著性（P＞0.05）。见图2。

2.8 各组大鼠肝脏p-NF-κB P65 蛋白表达的比较 大鼠肝脏p-NF-κB P65 的表达在模型组中各时相点间无明显差异，但在96 h 时有所减少。切痂组在同一时相点与模型组组间比较，48 h及72 h 均显著减少（P＜0.01），而在24 h 及96 h 差异无显著性（P＞0.05）；组内比较，72 h 及96 h 均较24 h 显著减少（P＜0.05 或P＜0.01）。假手术组中各时相点与模型组比较，差异均有显著性（P＜0.05 或P＜0.01）；与切痂组相同时相点比较，24 h 及48 h 差异有显著性（P＜0.05 和P＜0.01）；在组内比较中48 h 相对于24 h 呈显著减少（P＜0.01）。见图3。

图1 各组大鼠伤后不同时间p38MAPK 蛋白表达的比较

图2 各组大鼠伤后不同时间p-p38MAPK 蛋白表达的比较

图3 各组大鼠伤后不同时间p-NF-κB p65 蛋白表达的比较

3 讨 论

烧伤治疗一开始建议“保痂”治疗，但在保证血流动力学稳定的情况下越来越多的临床研究提示休克期切痂具有更好的救治效果[7]，原因在于焦痂的存在可能作为创面培养基导致细菌的侵袭与感染[2]。休克期切痂可以在体液渗出高峰期减少痂下水肿液，阻断细菌的繁殖，同时减少液体的重吸收，减少内毒素入血[8]。研究发现，在伤后6 h 便可能有细菌在创面繁殖并进一步侵入到深部组织，7 ～12 h 血浆中的内毒素（LPS）便可到达高峰且主要来自肠道[9-10]。LPS 结合血清中的LBP 来寻找目标细胞比如肝脏巨噬细胞表面的Toll 样受体（TLR），与受体结合后联级活化p38 并调节几种下游靶标，其中一种为NF-κB（p65），可使胞质内总NF-κB 部分磷酸化并进入细胞核，在转录翻译后释放大量的炎症因子比如IL-1β、 IL-6、TNF-α 和HMGB1 等[11-12]。HMGB1 在烧伤后全身炎症瀑布反应中起关键作用，可在早期皮肤成纤维细胞受损后释放出来并使免疫细胞聚集[13]，同时有研究发现HMGB1 可与LPS 协同增强p38MAPK和NF-κB 的磷酸化水平，从而加重炎症反应[14]。故早期切痂能明显减少HMGB1 的产生，并有助于预防多器官功能衰竭[15]。综上所述，休克期切痂有望从源头上减少LPS 及HMGB1 的产生并通过调控肝脏p38MAPK/NF-κB 通路减轻烧伤炎症反应。

本研究中模型组血清LBP 伤后48 h 就到达高峰且维持较高水平，HMGB1 的表达也逐渐增加。这两种炎症因子协同增强致使肝脏中的p38MAPK及NF-κB 过度磷酸化，于伤后12 h 及24 h 便产生较多的炎症介质IL-6、TNF-α，组内比较中两者虽在后期有所下降，但没有明显的统计学差异。当在休克期12 h 进行切痂手术后，LBP 在48 h 有一定减少，而在其余时相点的变化均无明显差异，考虑切痂后短时间内虽然阻断了痂下液体的吸收，但由于肠道菌群的作用，仍保持较高水平。而切痂后HMGB1 无论哪一时相点与模型组比较均呈明显的下降（P＜0.01），之后由于缺少了HMGB1与LPS 的相互作用，或者减少了痂下液体的回吸收入血，肝脏p38MAPK 及NF-κB 磷酸化水平与模型组比较呈明显降低，所产生的炎症因子IL-6 及TNF-α 也呈明显减少；与本组24 h 比较，切痂组术后48、72、96 h 血清中的促炎介质呈减少趋势，p38MAPK 及NF-κB 磷酸化水平、炎症因子与24 h 比较呈下降趋势，且于96 h 时差异均具有显著性（P＜0.05 或P＜0.01），而模型组内各时相点间没有明显的统计学差异，表明经过切痂手术后大鼠体内的炎症反应呈现更快的减少趋势。假手术组由于没有热力损伤，表现出较少的促炎因子水平，炎症通路磷酸化水平也较低。但炎症因子的存在证明手术也是一种致伤因素，会造成一定程度的炎症反应。抗炎因子IL-10 在机体处于抗炎平衡状态下时会随着炎症因子的增加而增加，平衡打破时炎症因子增加而IL-10 不增或降低。我们发现各组IL-10 均随着炎症因子的增加而增加，证明在实验中大鼠体内抗炎水平还处于动态平衡状态，并不会因为手术的进行而打破该平衡。

本实验证实休克期切痂虽不能在早期减少细菌LPS 的产生，但能通过阻断肝脏p38MAPK及NF-κB 炎症通路的活化而减少烧伤炎症因子HMGB1、IL-6、TNF-α 的产生，而且在切痂后全身炎症反应水平呈现出更快减少的趋势。本研究尚存在纳入样本量较少、观察时间较短的不足。对于焦痂及痂下液体的研究，如致炎成分、回吸收高峰期等，今后可以深入研究。