朱氏润肠方对慢传输型便秘大鼠的作用及其机制研究❋

孟 君，陆建良，孙 勇，周 青，严士海

(1. 南京中医药大学连云港附属医院，江苏 连云港 222001； 2. 江苏省中医院，南京 210029)

慢传输型便秘(slow transit constipation,STC)是指结肠传输功能障碍，肠内容物传输缓慢引起的便秘，其症状主要表现为大便次数减少、少便意或便意消失、粪质坚硬，一般伴有腹胀，其病因不清，症状顽固[1]。由于现代社会节奏加快，人们的精神压力增大，饮食和生活习惯的改变，使得慢传输型便秘的发病率逐年升高，严重影响患者的生活质量[2]。目前慢传输型便秘还是以西药治疗为主，但是患者需要长期用药，所以会带来很多不良反应，如电解质紊乱、胃肠功能障碍以及心血管事件等，而传统中医药治疗便秘历史悠久、疗效显著、不良反应少而轻，但其具体作用机制不明。

朱氏润肠方是我国首批老中医药专家师承指导老师朱秉宜教授的经验方。他提出“清”“润”两法，“以清代通、以润代泻”，清热润肠，滋阴增液，并研制出朱氏润肠方。本研究拟复制慢传输型便秘大鼠模型，观察朱氏润肠方的改善作用，并探讨其可能的作用机制，为中医药临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 动物

成年健康雄性Wistar大鼠50只，体质量(220±20) g，由南通大学动物中心提供(合格证号SCXK (苏)2014-0001)。

1.2 药物与试剂

大黄和朱氏润肠方均由连云港市中医院制剂部提供。朱氏润肠方组成：玄参、麦冬、生地黄、火麻仁、杏仁、全栝楼、生白术各20 g，升麻15 g，枳壳15 g，由连云港市中医院制剂部按照2010年版药典要求制备成水煎剂，约含生药量2 g/ml。根据文献[3]计算出中药人鼠等效剂量为朱氏润肠方低剂量(28.8 g/kg)，临床等效剂量的2倍为朱氏润肠方高剂量(57.6 g/kg)；枸橼酸莫沙必利片， 成都康弘药业集团股份有限公司(批号150413)；PI3K、p-PI3K、akt、p-akt抗体、GAPDH一抗(美国 Cell Signaling 公司)；ECL显色试剂盒、彩色预染蛋白分子量标准(Thermo公司)；PVDF膜(Millipore公司)；DAPI：凯基生物；Anti-AQP3抗体、Anti-AQP8抗体(Abcam公司)。

1.3 实验仪器

台式高速冷冻离心机(H1650R)，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；37 ℃恒温培养箱(DNP-9022)；上海精宏实验设备有限公司；显微镜CX31，日本 OLYMPUS；石蜡包埋机，上海精宏实验设备有限公司；石蜡超薄切片机 Leica 德国；ABI7500 Real-time PCR定量仪，美国ABI公司；Western SDS-Page 电泳仪，美国BIORAD公司。

2 方法

2.1 大鼠造模与给药

将50只大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、朱氏润肠方高剂量组、朱氏润肠方低剂量组和莫沙必利组每组各10只。根据文献[4]采用大黄致泻结肠法造模，除正常组外其余大鼠按150 mg/kg/d给予大黄悬浊液灌胃，随后灌胃剂量以150 mg/kg/d递增，直到50%大鼠出现腹泻，维持该剂量直到80%的大鼠稀便消失，再以150 mg/kg/d递增，直到50%大鼠出现腹泻并维持剂量至80%大鼠便秘，然后再加量，如此循环直到第3次出现80%的大鼠稀便消失，维持该剂量继续灌胃1周，发现大鼠毛发枯燥，易激怒，粪便量明显减少，质地偏硬，粪便含水量明显降低，表明慢传输型便秘模型复制成功。造模成功后第1天起给予相应药物进行干预，朱氏润肠方高剂量组、低剂量组和莫沙必利组大鼠分别以57.6 g/kg、28.8 g/kg和2.5 mg/kg灌胃给药，每日1次，连续15 d，正常组和模型组大鼠给予等量生理盐水。

2.2 测定24 h粪便总量与粪便含水量

收集造模后和治疗后各组大鼠24 h粪便总量，记录颗粒数并称湿重(A)，将粪便放入干燥箱中干燥3 h，称干重(B)，计算粪便含水量=(A-B)/A×100%。

2.3 活性炭悬液推进法测定大鼠肠道传输功能

在末次给药后禁食不禁水12 h，分别经口灌入印度墨汁2 ml，30 min后颈椎脱臼法处死，剖腹取出幽门到直肠末端全部肠道，在无张力状态下测量肠道全长及墨汁在肠道的推进距离，计算墨汁推进距离占肠道全长的百分比并进行结果比较。碳末推进百分率(%)=(碳末推进长度/肠道全长)×100。

2.4 免疫组化法检测大鼠结肠黏膜AQP3、AQP8表达

取各组大鼠距肛门11 cm处结肠1 cm，用生理盐水冲洗干净后放入4%的多聚甲醛中固定。石蜡包埋并切片，脱蜡水化，抗原修复；切片放入3%H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶，5%BSA封闭，每张切片加入50 μL稀释的一抗覆盖组织，4 ℃过夜； PBS冲洗加二抗，4 ℃孵育50 min；PBS冲洗加DAB溶液，苏木素复染，然后50%、70%、80%、90%、100%乙醇浸泡脱水，二甲苯1，2浸泡几分钟晾干，滴加中性树胶封片，干燥后置于显微镜观察。

2.5 荧光定量PCR检测大鼠AQP3、AQP8 mRNA表达

采用Trizol-离心柱法提取大鼠结肠组织细胞总RNA，测定RNA纯度，计算RNA溶液浓度，判断RNA提取质量：A260/A280>1.8且<2.0，则可以满足后续RT-qPCR所需。引物由南京拜睿生物科技有限公司合成，引物序列：AQP3：上游5’ CAAGCTGCCCATCTACAC 3’，下游5’ AAAGAAGCCATTGACCATAT 3’，产物长度189 bp；AQP8：上游5’ TCATTGGGTGTCTATCGG 3’，下游5’ AATTAGCAGCATGGTCTTG 3’，产物长度184 bp。内参GAPDH:上游5’AGGTCGGTGTGAACGGATTTG3’，下游5’TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA3’，产物长度126 bp。AQP3、AQP8及GAPDH的PCR参数为：95 ℃预变性30 s，进入PCR循环：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s, 40个循环。采用RT-PCR法检测大鼠结肠AQP3及AQP8表达，以GAPDH作为内参照，与目的产物进行比较。

2.6 Western Blotting法检测大鼠结肠PI3K、akt的表达

将各组大鼠结肠组织液氮研磨提取蛋白，采用 BCA 蛋白定量法测定蛋白浓度，电泳后的胶体经过转膜、封闭等步骤，孵上PI3K、p-PI3K、akt、p-akt、GAPDH一抗，放在冰箱中的摇床上 4 ℃过夜 12 h 后取出，PBS 冲洗 3 次，孵上二抗，常温下摇 1 h 后将膜取出，放入化学发光凝胶成像系统曝光，采用ImagePro Plus 6.0软件将扫描后的图像进行灰度分析。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 对STC大鼠粪便的影响

表1示，采用大黄灌胃之后，各造模组大鼠24 h粪便总量明显减少，粪便含水量也明显降低，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01)；经过相应药物干预之后，各治疗组大鼠情况均有所好转，朱氏润肠方高、低剂量组和莫沙必利组大鼠24 h粪便总量增加，质地变软，含水量明显增加，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。提示朱氏润肠方能增加STC大鼠的粪便总量与含水量，改善便秘症状。

3.2 对STC大鼠肠道传输功能的影响

表2示，与正常组比较，STC造模组大鼠碳末推进率明显降低(P<0.01)，而各治疗组大鼠的碳末推进率均明显提高，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，提示朱氏润肠方能增强STC大鼠肠道传输功能。

表2 朱氏润肠方对STC大鼠肠道传输功能的影响

3.3 对大鼠结肠黏膜AQP3、AQP8表达的影响

图1示，AQP3和AQP8阳性细胞均为棕黄色，与正常组比较，STC造模组大鼠结肠黏膜AQP3和AQP8阳性细胞比例明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)；经过相应药物干预，各治疗组大鼠黏膜呈浅棕黄色表达，朱氏润肠方高、低剂量组均能明显减少AQP3和AQP8阳性细胞的数量，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。提示朱氏润肠方能降低STC大鼠AQP3和AQP8的表达，治疗便秘。

3.4 对大鼠结肠AQP3、AQP8 mRNA表达的影响

图1 朱氏润肠方对大鼠结肠黏膜AQP3、AQP8表达的影响(免疫组化，×400)

表3示，与正常组比较，STC造模组大鼠结肠AQP3和AQP8 mRNA的表达明显升高(P<0.01)；而经过相应药物干预之后，各治疗组大鼠AQP3和AQP8 mRNA的表达明显降低，朱氏润肠方高剂量组降低尤其明显，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，与免疫组化的结果类似。提示AQP3和AQP8表达升高可能是导致慢传输型便秘的病理机制之一，而朱氏润肠方可能通过降低AQP3和AQP8的表达来改善慢传输型便秘。

3.4 对大鼠结肠PI3K、akt表达的影响

图2表4示，Western Blot结果显示，各组大鼠结肠PI3K、akt的表达差异不大(P>0.05)。与正常组比较，模型组大鼠结肠p-PI3K、p-akt的表达明显升高(P<0.01)；而经过相应药物干预之后，各治疗组大鼠p-PI3K、p-akt的表达明显降低，朱氏润肠方高剂量组降低最明显，差异有统计学意义(P<0.01)。提示PI3K/akt信号通路激活可能在慢传输型便秘的发生发展中起重要作用，而朱氏润肠方通过抑制该通路的磷酸化来改善慢传输型便秘。

表3 朱氏润肠方对大鼠结肠AQP3、AQP8 mRNA表达的影响

注：图中1-5分别代表正常组、模型组、朱氏润肠方高剂量组、朱氏润肠方低剂量组与莫沙必利组图2 朱氏润肠方对大鼠结肠PI3K/akt表达的影响

4 讨论

慢传输型便秘是一种临床常见疾病，尤其是中老年人居多，患者主要表现为大便秘结、排便次数减少、腹胀等，还会引起一些心理疾病，严重影响患者的生活质量。但是，目前慢传输型便秘的病因及发病机制尚不完全明确。中医认为慢传输型便秘病变部位主要在大肠，其病机主要表现为气虚、阴虚两方面[5]，导致肠道干涩不润、腑气滞留不下。朱氏润肠方是朱秉宜的经验方，该方健脾益肾补其气血，增液润肠，行气导滞[6]，从而疗效显著，得到患者的肯定，但其作用机制尚不明确。因此，本研究旨在观察其疗效，探讨其机制。

本实验采用大黄灌胃复制慢传输型便秘模型，观察大鼠的一般体征，如毛发枯燥，活动减少，饮食量减少，大便量少而干燥，与临床STC患者症状类似。采用活性炭悬液推进法测定大鼠的肠道传输功能，发现肠道碳末推进率明显降低。经过相应药物干预之后，证实朱氏润肠方可以增加大鼠的粪便总量和粪便含水量，提高大鼠肠道碳末推进率，改善慢传输型便秘症状。

表4 朱氏润肠方对大鼠结肠PI3K/akt表达的影响

随着近年来病理生理学以及分子生物学的快速发展，慢传输型便秘已被证实与肠道水通道蛋白(AQPs)密切相关。AQPs属通道蛋白MIP家族成员，是一种位于细胞膜上的蛋白质(内在膜蛋白)，在细胞膜上组成“孔道”，通过调整生物膜的透水性，介导水由低渗区向高渗区移动，参与水的分泌、吸收等，广泛分布于消化道，在消化道水分的转运中起重要作用。而AQPs在结肠的异常表达，使得结肠中水的重吸收过多，分泌过少，可能是导致慢传输型便秘的主要原因之一[7]。众多国内外文献认为，与便秘相关的主要是AQP3和AQP8。

AQP3和AQP8分布于肠上皮细胞内，可吸收肠腔内水分，改变肠腔的内分泌环境。研究表明，便秘患者结肠中AQP3表达升高，使得结肠中水分重吸收增多，大便干燥，传输速度减慢，时间延长[8-9]。AQP8在结肠水分转运过程中也起了重要作用，在腹泻患者结肠中表达降低，在便秘患者结肠中表达明显升高[10-11]。目前在临床上，朱氏润肠方对便秘疗效显著，停药后未见明显反弹。在解除便秘的同时，调整了紊乱的胃肠功能，并使患者的体质状况得到改善，是否与水通道蛋白调节肠道水液代谢有关？本实验中通过免疫组化法和RT-PCR法检测发现，STC大鼠结肠AQP3和AQP8的表达明显升高，而朱氏润肠方可以降低AQP3和AQP8的表达。实验结果表明，朱氏润肠方可以通过降低AQP3和AQP8的表达改善STC症状。

朱氏润肠方如何可以降低AQP3和AQP8的表达？本文进一步实验欲探索可能的作用机制。众多研究证实，PI3K(磷脂酰肌醇3激酶) /akt(蛋白激酶B)信号传导通路在细胞增殖、分化、凋亡、炎症、氧化应激等方面起到了重要作用。李旻昊[12]和孙路强[13]等证实，PI3K /akt通路在慢传输型便秘中也起关键作用，当便秘发生时PI3K和akt的表达明显增加。国内外众多研究表明，发生慢传输型便秘后，机体释放出神经细胞生长因子等激活具有酪氨酸激酶活性的受体，随即特异性地结合PI3K调节亚基，激活后的PI3K可以使细胞膜上的肌醇发生磷酸化生成第二信使，结合其下游的效应分子akt，使akt的Thr308位点以及Ser473位点发生磷酸化，由抑制状态变为激活状态成为p-akt[14]。p-akt作用于下游水通道蛋白AQP3和AQP8，增加肠道对水的重吸收，使大便干燥造成便秘[15]。本实验结果发现，慢传输型便秘大鼠肠道磷酸化的PI3K和akt表达明显增多，下游水通道蛋白AQP3和AQP8的表达也明显升高，与文献报道一致。经朱氏润肠方干预之后，PI3K/akt的磷酸化水平降低，水通道蛋白AQP3和AQP8表达也降低，便秘症状得到改善。

综上所述，朱氏润肠方对慢传输型便秘具有明显的改善作用，其机制可能是通过抑制PI3K/akt信号通路，从而降低AQP3和AQP8的表达，减少肠道对水的重吸收，增加肠液的分泌，改善肠腔的内分泌环境。本研究为传统经验方的发展提供了理论和实验依据，深入的分子机制研究与靶点治疗将是下一步的研究重点。