血橙果醋发酵工艺

陈 静，王朝霞，朱桂兰，鲁红侠，班 恒，张 瑜

（合肥师范学院生命科学学院，安徽合肥 230061）

随着生活水平的日益提高，绿色健康食品也越来越受到大众的重视和喜爱。果醋是近年来发展起来的一种新型高价值营养型饮品[1]。果醋集水果和食醋的优点于一身，以水果或果品加工下脚料为主要原料，利用现代生物技术酿制而成。不仅风味优良而且还含有丰富的营养物质和生物活性保健成分[2]。研究发现，果醋具有多种保健功效[3-5]：①经常食用果醋，能降低胆固醇；②果醋中含有丰富的维生素、氨基酸和氧，能在体内与钙质合成醋酸钙，增强钙质的吸收；③果醋中还含有丰富的维C，能防止细胞癌变和细胞衰老；④果醋中所含有的有机酸、甘油和醛类物质，可以平衡皮肤的pH值，控制油脂分泌、扩张血管；⑤能促进身体的新陈代谢、调节酸碱平衡、消除疲劳。

血橙（Citrus sinensis L，Osbeck），芸香科柑橘属下甜橙类，果肉成熟时橙红或紫红色，是柑橘中唯一含花色苷的品种[6]。血橙不仅果肉细嫩、香味浓郁，而且营养价值高，含有丰富的维C、类黄酮、花青素和多酚等生物活性物质，具有抗氧化、促进血液循环、改善贫血、提高机体免疫力等药用价值，深受广大消费者的喜爱[7-8]。

血橙首次出现在1850年的欧洲，主要种植在西班牙、意大利和北美等区域。中国各地有大量栽培，主要产区在四川、江西。目前，血橙主要以鲜果销售的方式出售，然而血橙鲜果采摘周期短，上市时间较为短暂集中，且不耐贮藏，不能像苹果一样实现周年供应。关于血橙深加工产品的研究较少，主要集中在果汁[9-11]和果酒[12-13]等产品。为进一步加强血橙深加工，缓解鲜销压力的同时也能够扩大产业链。以血橙为原料，采取两步液态发酵法，研究了酒精发酵阶段和醋酸发酵阶段的关键技术，从而进一步优化血橙果醋的加工工艺条件，为血橙果醋的酿造工艺提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

血橙，重庆万州提供；果胶酶，郑州超凡化工有限公司提供；食用级白砂糖，中粮集团提供；安琪酵母葡萄酒果酒专用酵母SY，安琪酵母股份有限公司提供；沪酿1.01醋酸菌，上海酿造一厂提供；氢氧化钠、酚酞，国药集团化学试剂有限公司提供。所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

L13-Y91型榨汁机，九阳股份有限公司产品；电子分析天平、722s型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品；JK-3200B型超声波清洗器，合肥市尼克机械制造有限公司产品；恒温水浴锅，江苏省金坛市杰瑞尔电器有限公司产品；Anke TDL-5A型离心机，上海安亭科学仪器厂产品；WAY-2W型阿贝折光仪，上海精科物光有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

选果→去皮→压榨→脱苦澄清→过滤→酒精发酵→醋酸发酵→澄清→杀菌。

1.3.2 预处理

将新鲜血橙静置24℃条件下12 d脱苦[14]，清水冲洗干净后剥皮，去囊衣，榨汁，过滤，然后向其加入果胶酶进一步澄清去苦，50℃下水浴2 h，再用纱布过滤，得到脱苦、澄清的橙汁，用于酒精发酵。

1.3.3 酒精发酵阶段单因素试验

（1）加糖量的影响。将脱苦澄清后的橙汁接种已活化酵母菌，28℃下恒温发酵5 d，其中每组加糖量分别为0，30，60，90 g/L，测评发酵结束后的酒精度，计算乙醇转化率。

（2）发酵温度的影响。将脱苦澄清后的橙汁接种已活化酵母菌，初始糖度30 g/L，分别静置于18，23，28，33℃的恒温箱发酵5 d，测评发酵结束后的酒精度，计算乙醇转化率。

（3）发酵时间的影响。将脱苦澄清后的橙汁接种已活化酵母菌，初始糖度30 g/L，28℃下恒温发酵，分别测评发酵时间为2，4，6，8 d后的酒精度，计算乙醇转化率。

1.3.4 醋酸发酵阶段单因素试验

（1）醋酸菌接种量对产酸的影响。在酒精度为6%，按20%的装液量，初始pH值4，温度35℃的条件下，在转速为120 r/min的恒温摇床环境中发酵5 d，将3%，6%，9%，12%醋酸菌种液接入酒液中，测评发酵结束后的酸度，计算产酸转化率。

（2）初始发酵pH值对产酸的影响。在酒精度为6%，按20%的装液量，10%醋酸菌种子液，温度35℃条件下，在转速为120 r/min的恒温摇床环境中发酵5 d，将初始发酵pH值调至3.5，4.0，4.5，5.0，测评发酵结束后的酸度，计算产酸转化率。

（3） 不同装液量对产酸的影响。在酒精度为6%，10%醋酸菌种子液，初始pH值4，温度35℃条件下，分别按10%，20%，30%，40%的装液量，在转速为120 r/min的恒温摇床环境中发酵5 d，测评发酵结束后的酸度，计算产酸转化率。

1.3.5 正交试验

在醋酸发酵阶段各单因素试验的基础上，选择醋酸菌接种量、装液量、初始pH值为考查因素，以产酸的质量浓度和产酸转化率为评价指标，进行三因素三水平正交试验。

1.3.6 理化指标检测

酒精度采用GB 5009.225—2016标准中比重法测定乙醇质量浓度[15]，根据《酒精生产分析检验》[16]将酒精度换算成酒精浓度，计算乙醇转化率；糖度采用阿贝折光仪测定；酸度参考GB/T 12456—2008标准[17]中酸碱滴定法测定，并计算总酸转化率。

2 结果与分析

2.1 酒精发酵阶段

2.1.1 不同加糖量对酒精发酵阶段的影响

不同加糖量对乙醇质量浓度和乙醇转化率的影响见图1。

在酒精发酵阶段，葡萄糖经过充分发酵，转化为足量的乙醇是保证下一阶段醋酸发酵产酸充足的重要条件。由图1可知，随着加糖量从0增加到90 g/L时，产出的乙醇质量浓度从33.92 g/L不断增加到75.14 g/L，呈现出逐渐增大的趋势，乙醇转化率却呈现先增大再减小的趋势，在加糖量为30 g/L时转化率达最大值，为86.89%。因为酒精发酵过程主要是酵母菌利用糖类，在无氧的环境下将其转化为酒精和二氧化碳，发酵液糖质量浓度会直接影响产酒量。原果汁中的糖质量浓度为102 g/L，随着加糖量增加，待发酵血橙汁中糖质量浓度也增加，在糖质量浓度较低时产酒量较低，随着糖质量浓度逐渐增加，产出乙醇质量浓度逐渐增加，但糖浓度过高会影响酵母的生长代谢和发酵，使得发酵进行不彻底，从而影响酵母对糖的利用效率，表现出乙醇转化率随着糖量增加却下降的现象。因此，较佳的初始加糖量为30 g/L，此时乙醇质量浓度为57.73 g/L，乙醇转化率为86.89%。

2.1.2 不同发酵温度对酒精发酵阶段的影响

不同发酵温度对乙醇质量浓度和乙醇转化率的影响见图2。

发酵阶段合理的温度控制对于酵母菌在橙汁中的生长繁殖和发酵活动至关重要。由图2可知，随着酒精发酵温度从18℃增加到33℃，产出乙醇质量浓度呈现先增大后减小的趋势，在发酵温度为28℃时乙醇质量浓度最大，为47.13 g/L；乙醇转化率也相应呈现出先增大后减小的趋势，同时在28℃时，乙醇转化率达最大值92.22%。因为25～30℃是酵母菌的生长适宜温度，当温度过低或过高时，酵母菌的生长繁殖和发酵活动都不能高效率进行，酵母菌将糖转化成酒精的活动就会受到影响，进而影响产酒量和产酒转化率。因此，酒精发酵的较佳温度是28℃，在此条件下乙醇质量浓度为47.13 g/L，乙醇转化率为92.22%。

2.1.3 不同发酵时间对酒精发酵阶段的影响

不同发酵时间对乙醇浓度和乙醇转化率的影响见图3。

酒精发酵主要分为发酵前期、主发酵期和后发酵期3个阶段。由图3可知，随着酒精发酵时间从2 d增加到8 d，产出乙醇质量浓度呈现先增大后平稳趋势，在发酵第6天乙醇质量浓度达最大值，且第8天的乙醇质量浓度未发生明显变化；乙醇转化率也呈现出先增大后平稳的趋势，且在发酵第6天乙醇转化率达最大值，第8天乙醇转化率无明显变化。因为在发酵前期，发酵液中主要进行的是酵母菌的有氧繁殖，故此时产酒量不佳，乙醇转化率较低；当氧气含量逐渐降低，发酵液中主要进行酵母菌无氧发酵时，产酒量明显增加，乙醇转化率也较高；此后，随着糖分逐渐消耗殆尽，发酵过程慢慢结束，发酵液中不再产酒，乙醇转化率趋于平稳。因此，酒精发酵的较佳时间为6 d，在此条件下乙醇质量浓度为61.72 g/L，乙醇转化率为92.86%。

2.2 醋酸发酵阶段

2.2.1 不同醋酸菌接种量对醋酸发酵阶段的影响

不同醋酸菌接种量对醋酸发酵阶段的影响见图4。

由图4可知，当醋酸接种量从3%增加到12%时，总酸质量浓度呈现出先增大后减小的趋势，在接种量为9%时，产酸量最大，为41.60 g/L；产酸转化率也呈现出先增大后减小的趋势，在接种量为9%时，产酸转化率达最大值65.86%。在一定接种量范围内，随着接种量增大，醋酸菌能高效利用营养物质产酸，当接种量过高，醋酸菌利用发酵液中营养物质进行繁殖，产生过量的代谢产物，影响产酸，使得产酸量和总酸转化率较低。因此，血橙果醋较佳的醋酸菌接种量为9%，在此条件下总酸质量浓度为41.60 g/L，产酸转化率为65.86%。

2.2.2 不同初始pH值对醋酸发酵阶段的影响

由图5可知，当初始pH值从4.0增加到5.5时，总酸质量浓度呈现出先上升后下降的趋势，当pH值为5.0时，总酸质量浓度达最大值48.74 g/L；总酸转化率也呈现出先上升后下降的趋势，当pH值为5.0时，总酸转化率也达最大值，为77.11%。pH值为3.5～6.0时，较适宜醋酸菌生长代谢，pH值过高或过低都会对醋酸菌生长代谢和有氧发酵产生不利影响，抑制产酸活动。血橙果醋较佳的发酵初始pH值为5.0，在此条件下，总酸质量浓度为48.74 g/L，总酸转化率为77.11%。

不同初始pH值对总酸质量浓度和总酸转化率的影响见图5。

2.2.3 不同装液量对醋酸发酵阶段的影响

不同装液量对总酸质量浓度和总酸转化率的影响见图6。

由图6可知，当装液量从10%增加到40%时，总酸质量浓度呈现出先上升后下降的趋势，当装液量为30%时，总酸质量浓度达最大值43.11 g/L；总酸转化率也呈现先升后降趋势，当装液量为30%时，总酸转化率达最大值68.34%。当装液量较低时，发酵液中酒精含量较少，产酸较少，同时由于装液量较低，总酸有部分挥发，而导致总酸转化率较低；当装液量较高的时候，发酵液中的氧气体积含量减小，醋酸菌不能充分进行有氧发酵，从而导致总酸降低，总酸转化率也降低。因此，30%装液量是较佳装液量，在此条件下，总酸质量浓度达最大值，为43.11 g/L；总酸转化率也达最大值68.34%。

2.3 血橙果醋醋酸发酵阶段正交试验

正交因素与水平设计见表1，醋酸发酵阶段正交试验结果见表2。

表1 正交因素与水平设计

表2 醋酸发酵阶段正交试验结果

由表1可知，在血橙果醋发酵阶段各单因素试验中，选择醋酸菌接种量、装液量、初始pH值为试验因素，以总酸质量浓度为评价指标，进行三因素三水平正交试验，从而得出发酵阶段更佳的工艺条件。

由表2可知，各因素对总酸质量浓度影响大小关系为A＞B＞C，即接种量＞初始pH值＞装液量，较佳水平为A2B3C3，即接种量为9%，初始pH值为5.0，装液量为30%时为较佳发酵工艺条件，此时总酸质量浓度为49.81 g/L，总酸转化率为78.92%。

3 结论

以血橙为原料，采取两步液态发酵法，优化了血橙果醋酿造工艺。通过试验得出最佳的工艺参数为酒精发酵阶段，加糖量30 g/L，发酵温度28℃，发酵时间6 d，产出乙醇质量浓度为61.7 g/L，乙醇转化率最高为92.86%；醋酸发酵阶段，醋酸菌接种量9%、初始pH值5.0、装液量30%、发酵5 d时，总酸质量浓度达到49.8 g/L，总酸转化率最高为78.92%，为血橙果醋的酿造提供一定的理论基础。