新型丹皮酚嘧啶类化合物的合成及抗肿瘤活性

辛 懋, 庞富华, 黄 琳, 周小群, 王萌迪, 李金林, 李芳耀

(桂林医学院 药学院,广西 桂林 541199)

Scheme 1

丹皮酚又称芍药醇、牡丹酚，化学名为2-羟基-4-甲氧基苯乙酮，是一种从毛茛科植物牡丹的皮或萝藦科植物徐长卿中提取的天然产物[1]。作为牡丹皮的主要活性成份，具有抗炎[2]，抗肿瘤[3-7]，抗动脉粥样硬化[8]，抗糖尿病[9]，抗诱变[10]以及抗神经炎症[11]等活性。丹皮酚毒副作用小，简单的结构也使得结构修饰过程便捷易行，是天然的活性先导化合物。

嘧啶是一类重要的含氮杂环化合物，是很多药物中的活性结构单元，嘧啶类化合物因其具有高效、低毒，药理活性多样及其环上取代基可以多方位变换等特点而备受药物学家的关注。尤为重要的是众多含嘧啶结构的化合物具有良好的抗肿瘤活性，能抑制多种肿瘤细胞的形成、增殖，还可以诱导细胞凋亡[12-17]。代表性药物氟尿嘧啶合成至今已有60余年历史，抗肿瘤谱广，目前仍是包括消化系统肿瘤在内的多种恶性肿瘤的基础性治疗药物。

杂合是获得新型抗肿瘤药物的有效的策略之一，杂合是利用拼合原理将两个或多个活性物质的药效团嵌到一起形成一个全新的杂交分子，通过增加药物的作用靶点，改变药物对受体的作用方式以增强活性。有文献[18-20]报道，四个碳原子的烷基链是良好的连接臂。

本文在前期研究基础上[21-23]，以丹皮酚(1)为先导化合物，利用拼合原理将丹皮酚与嘧啶两种具有抗肿瘤活性的活性亚结构进行拼合，合成一系列新型丹皮酚嘧啶类化合物(4a～4k, Scheme 1)，其结构经1H NMR、13C NMR、 IR和MS(ESI)表征。并采用MTT法测定化合物对HepG2(人肝癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、HCT-116(人结肠癌细胞)、A549(人肺癌细胞)和LO2(人正常肝细胞)等5种细胞的抑制活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

WRX-4型熔点仪；Bruker AVANCE AV 600 MHz型核磁共振仪(TMS为内标)；Simadzu Prestige-21 FT IR型红外光谱仪(KBr压片)；Simadzu LCMS-8030型液相色谱-质谱联用仪；Infinite F500滤光片多功能酶标仪；OLYMPUS BX51型荧光倒置显微镜。

人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人结肠癌细胞株HCT-116、人肺癌细胞株A549和人正常肝细胞LO2由桂林医学院第一附属医院实验室提供；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 2-(4-溴丁烷氧基)-4-甲氧基苯乙酮(2)的合成[24]

在250 mL的圆底烧瓶中加入12.50 g(15.0 mmol)与碳酸钾2.10 g(15.0 mmol)，用80 mL丙酮溶解；常温搅拌下加入1, 4-二溴丁烷(2)5.50 mL(48.0 mmol)，回流反应6 h[TLC跟踪,展开剂：V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=4/1]。加入无水硫酸镁，干燥过夜。过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析[洗脱剂：V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=10/1]纯化得白色固体(2)2.60 g, Rf=0.28，收率58.0%, m.p.51.4～53.0 ℃; IRν: 2956(CH3), 1651(C=O), 1595, 1500, 1406, 1359, 1328, 1257, 1124, 1024, 837, 756, 646, 584, 522 cm-1。

(2) 6-取代苯基-5-氰基-2-硫代尿嘧啶(3a～3h)[25]

将氰乙酸乙酯1.13 g(0.01 mol)， 0.76 g硫脲(0.01 mol)，不同取代基的芳香醛(0.01 mol)和碳酸钾1.38 g(0.01 mol)加入20 mL无水乙醇溶液中回流5～8 h，TLC监测反应。反应完成后产物以钾盐的形式析出，减压抽滤，将沉淀溶解在温水中后通过乙酸使其酸化而再次沉淀，减压抽滤后干燥，经乙酸重结晶，纯化得6-取代苯基-5-氰基-2-硫代尿嘧啶(3a～3h)。

(3) 丹皮酚嘧啶类化合物(4a～4k)的合成

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将新制备的2-(4-溴丁烷氧基)-4-甲氧基苯乙酮(2)0.30 g(1 mmol)溶解于装有20 mL无水乙醇的圆底烧瓶中，加入不同的嘧啶类化合物(3a～3k， 1 mmol)，以碳酸钾为催化剂，水浴升温至78 ℃，回流搅拌反应约7～8 h，TLC跟踪反应进程(展开剂：V(氯仿)/V(甲醇)=2/1)待反应结束后，加入无水硫酸镁干燥过夜后过滤，滤液减压蒸干后经硅胶柱层析(展开剂：V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=1/1)纯化得到目标化合物4a～4k。

6-(3-氟苯基)-5-氰基-4-羟基-2-丹皮酚丁巯基嘧啶(4a): 白色固体,收率32.1%, m.p.81.7～83.6 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.82(dd,J=8.9 Hz,J=5.6 Hz, 2H), 7.65(d,J=8.7 Hz, 1H), 7.27(t,J=8.9 Hz, 2H), 6.62(d,J=2.2 Hz, 1H), 6.58(dd,J=8.7 Hz,J=2.3 Hz, 1H), 4.14(t,J=6.1 Hz, 2H), 3.83(s, 3H), 3.07(t,J=6.8 Hz, 2H), 2.51(s, 3H), 1.88(dt,J=14.8 Hz,J=8.3 Hz, 4H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 196.73, 172.45, 166.19, 164.73, 164.54, 162.09, 160.83, 134.68, 132.20, 130.90, 130.81, 120.74, 120.64, 115.58, 115.36, 106.47, 99.26, 88.99, 68.47, 56.05, 32.34, 29.75, 28.20, 26.65; IRν: 2 947(CH3), 2 214(CN), 1664(C=O), 1600, 1502, 1485, 1396, 1357, 1303, 1263, 1199, 1153, 1028, 999, 964, 796, 729, 646, 566, 507 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C24H22N3O4SF{[M+H]+}467.13, found 467.10。

6-苯基-5-氰基-4-羟基-2-丹皮酚丁巯基嘧啶(4b): 淡黄色固体,收率78.0%, m.p.80.3～82.4 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.75(dd,J=7.0 Hz,J=2.7 Hz, 2H), 7.65(d,J=8.7 Hz, 1H), 7.45(d,J=2.0 Hz, 2H), 7.44(d,J=1.7 Hz, 1H), 6.63(d,J=2.2 Hz, 1H), 6.58(dd,J=8.7 Hz,J=2.3 Hz, 1H), 4.14(t,J=6.1 Hz, 2H), 3.83(s, 3H), 3.07(t,J=6.8 Hz, 2H), 2.50(s, 3H), 1.92(dd,J=12.4 Hz,J=7.7 Hz, 2H), 1.84(dd,J=14.6 Hz,J=7.0 Hz, 2H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 196.74, 172.42, 170.88, 167.40, 164.74, 160.85, 138.30, 132.20, 130.07, 128.52, 120.78, 120.64, 106.51, 99.25, 89.16, 68.50, 56.06, 32.35, 29.77, 28.22, 26.66; IRν: 3086(CH3), 2229(CN), 1687(C=O), 1548, 1456, 1396, 1328, 1226, 1145, 1109, 1006, 856, 748, 698, 653, 547, 518 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C24H23N3O4S{[M-H]-}448.14, found 448.00。

6-(2-氟苯基)-5-氰基-4-羟基-2-丹皮酚丁巯基嘧啶(4c): 棕黄色固体,收率10.7%, m.p.98.6～100.2 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.82(dd,J=8.7 Hz,J=6.0 Hz, 2H), 7.27(s, 1H), 6.55～6.45(m, 2H), 6.43(d,J=1.9 Hz, 2H), 4.05(d,J=6.2 Hz, 2H), 3.85(s, 3H), 2.79(d,J=7.9 Hz, 2H), 2.58(s, 3H), 2.03～1.90(m, 2H), 1.82(dt,J=14.6 Hz,J=7.2 Hz, 2H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 197.69, 164.48, 164.46, 160.40, 160.11, 132.77, 132.71, 121.24, 121.21, 105.20, 105.08, 99.00, 98.91, 67.97, 67.73, 55.57, 55.55, 52.06, 32.11, 31.93, 31.78, 28.31, 26.26, 19.94; IRν: 2937(CH3), 1658(C=O), 1600, 1496, 1436, 1386, 1357, 1273, 1203, 1170, 1143, 1066, 1028, 966, 921, 827, 732, 642, 570, 524 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C24H22N3O4SF{[M+H]+}467.13, found 467.00。

6-(3-羟基苯基)-5-氰基-4-羟基-2-丹皮酚丁巯基嘧啶(4d): 灰白色固体,收率47.1%, m.p.205.6～206.3 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.81(s, 1H), 7.64(d,J=8.5 Hz, 1H), 7.32(d,J=2.4 Hz, 3H), 6.95(d,J=7.8 Hz, 1H), 6.60(t,J=11.0 Hz, 2H), 4.13(s, 2H), 3.82(s, 3H), 3.29(s, 2H), 2.42(s, 3H), 1.91(s, 4H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 196.60, 167.52, 164.70, 162.81, 160.69, 157.76, 155.70, 137.45, 132.22, 129.98, 122.95, 120.72, 119.68, 118.78, 115.72, 106.44, 99.35, 68.32, 62.82, 56.05, 32.21, 30.41, 28.09, 26.17； IRν: 3599, 3361, 3269, 2941(CH3), 2210(CN), 1664(C=O), 1573, 1469, 1301, 1269, 1205, 1174, 1141, 1020, 964, 812, 702, 636, 574, 470 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C24H23N3O5S{[M-H]-}464.14, found 464.00。

6-(4-甲基苯基)-5-氰基-4-羟基-2-丹皮酚丁巯基嘧啶(4f): 白色固体,收率64.8%, m.p.102.4～104.0 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.86(d,J=8.2 Hz, 2H), 7.64(d,J=9.3 Hz, 1H), 7.32(d,J=8.1 Hz, 2H), 6.62～6.56(m, 2H), 4.12(s, 2H), 3.82(s, 3H), 3.34(s, 2H), 2.39(s, 3H), 2.37(s, 3H), 1.92(s, 4H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 196.56, 167.49, 166.24, 164.68, 160.64, 142.58, 132.90, 132.24, 129.61, 129.10, 120.77, 116.51, 106.32, 99.44, 92.88, 68.21, 56.05, 32.15, 30.47, 28.08, 26.17, 21.53; IRν: 3344, 2937(CH3), 2204(CN), 1656(C=O), 1604, 1552, 1471, 1274, 1201, 1147, 1031, 1004, 829, 796, 725, 644, 570, 499 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C25H25N3O4S{[M-H]-}462.16, found 462.00。

6-(4-溴苯基)-5-氰基-4-羟基-2-丹皮酚丁巯基嘧啶(4g): 白色固体,收率82.1%, m.p.224.4～226.1 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.87(d,J=8.6 Hz, 2H), 7.73(d,J=8.6 Hz, 2H), 7.64(d,J=9.3 Hz, 1H), 6.59(d,J=6.7 Hz, 2H), 4.12(s, 2H), 3.82(s, 3H), 3.34(s, 2H), 2.40(s, 3H), 1.91(s, 4H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 196.55, 166.77, 166.58, 164.65, 161.33, 160.59, 134.87, 132.25, 131.03, 126.05, 120.76, 116.21, 106.29, 99.46, 93.64, 83.29, 68.19, 56.06, 32.15, 30.48, 28.04, 26.14; IRν: 3286, 2937(CH3), 2191(CN), 1653(C=O), 1600, 1539, 1465, 1259, 1195, 1099, 1068, 991, 827, 800, 725, 642, 613, 514 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C24H22N3O4SBr{[M-H]-}526.05, found 525.90。

6-(4-甲氧苯基)-5-氰基-4-羟基-2-丹皮酚丁巯基嘧啶(4h): 黄色固体,收率67.2%, m.p. 223.1～224.6 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.83(d,J=8.9 Hz, 2H), 7.71(d,J=8.7 Hz, 1H), 7.04(d,J=8.9 Hz, 2H), 6.69(d,J=2.3 Hz, 1H), 6.64(dd,J=8.7 Hz,J=2.3 Hz, 1H), 4.20(t,J=6.1 Hz, 2H), 3.88(s, 3H), 3.86(s, 3H), 3.12(t,J=6.9 Hz, 2H), 2.51(s, 3H), 1.97(dd,J=13.9 Hz,J=6.1 Hz, 2H), 1.90(dd,J=14.6 Hz,J=7.0 Hz, 2H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 196.70, 172.18, 171.12, 166.52, 164.71, 162.78, 160.88, 132.17, 130.56, 130.07, 121.14, 120.71, 113.83, 106.50, 99.30, 88.34, 68.52, 56.06, 55.70, 32.31, 29.76, 28.24, 26.72; IRν: 3207, 2950(CH3), 2364, 2204(CN), 1658(C=O), 1604, 1554, 1400, 1255, 1203, 1170, 1029, 1004, 972, 831, 802, 698, 648, 574, 513 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C25H25N3O5S{[M-H]-}478.15, found 478.00。

6-甲基-4-羟基-2-丹皮酚丁巯基嘧啶(4i): 白色晶体,收率42.3%, m.p. 106.4～107.5 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.66(d,J=8.7 Hz, 1H), 6.71～6.53(m, 2H), 5.97(s, 1H), 4.14(t,J=5.7 Hz, 2H), 3.83(s, 3H), 3.20(t,J=6.6 Hz, 2H), 2.46(s, 3H), 2.15～2.05(m, 3H), 1.89(dtdd,J=14.5 Hz,J=11.1 Hz,J=5.5 Hz,J=2.3 Hz, 4H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 200.80, 170.14, 164.94, 164.73, 163.20, 160.50, 131.70, 121.23, 107.89, 102.67, 101.32, 69.40, 55.64, 31.98, 28.84, 28.20, 26.28, 24.74; IRν: 3574, 3126, 2949(CH3), 1653(C=O), 1593, 1452, 1402, 1251, 1205, 1026, 962, 908, 835, 565, 513, 530 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C18H22N2O4S{[M-H]-}361.13, found 361.00。

4-羟基-2-丹皮酚丁巯基嘧啶(4j): 白色固体,收率28.6%, m.p. 75.5～77.9 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.83(d,J=8.7 Hz, 2H), 6.42(s, 2H), 6.37(d,J=5.7 Hz, 1H), 4.41(t,J=5.4 Hz, 2H), 3.84(s, 3H), 3.21(t,J=6.6 Hz, 2H), 2.58(s, 3H), 1.69(s, 2H), 1.26(s, 2H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 197.68, 171.37, 168.59, 164.48, 160.42, 157.31, 132.74, 121.20, 105.09, 103.91, 98.93, 67.95, 55.54, 32.09, 30.44, 28.32, 25.93; IRν: 3292(NH), 2924(CH3), 1654, 1602, 1558, 1500, 1436, 1350, 1309, 1225, 1205, 1118, 1037, 987, 825, 640, 578, 514 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C17H20N2O4S{[M-H]-}348.11, found 348.80。

4, 6-二甲基-2-丹皮酚丁巯基嘧啶(4k): 淡黄色固体,收率61.2%, m.p. 75.5～77.9 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.83(d,J=8.7 Hz, 1H), 6.68(s, 1H), 6.51(dd,J=8.8 Hz,J=2.3 Hz, 1H), 6.43(d,J=2.3 Hz, 1H), 4.09(t,J=6.0 Hz, 2H), 3.84(s, 3H), 3.24(t,J=6.8 Hz, 2H), 2.55(s, 3H), 2.38(s, 6H), 2.07～2.00(m, 2H), 2.01～1.92(m, 2H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 197.72, 170.96, 166.99, 164.49, 160.52, 132.70, 121.14, 115.65, 105.05, 98.82, 68.02, 55.53, 32.15, 30.25, 28.24, 26.28, 23.88; IRν: 2945(CH3), 1656(C=O), 1598, 1533, 1436, 1396, 1359, 1263, 1195, 1134, 1029, 964, 831, 744, 555 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C19H24N2O3S{[M-H]-}360.15, found 360.20。

1.2 目标化合物的抗肿瘤活性

将HepG2(人肝癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、HCT-116(人结肠癌细胞)、A549(人肺癌细胞)和LO2(人正常肝细胞)在DEME培养基：胎牛血清：双抗(青链霉素)=100：10：1的完全培养基中培养，置于37 ℃，5% CO2的培养箱内培养，以细胞每孔1×105的密度接种在96孔板中培养，在96孔板的四周加入相同体积的PBS，轻轻拍打96孔板的周围，使细胞分布均匀，分别按不同计量浓度加入顺铂、丹皮酚及合成的丹皮酚嘧啶类化合物并孵育44 h后每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL)处理4 h，终止培养。离心，小心吸弃孔内培养上清液，最后每孔加入150 μL的DMSO，震荡10 min’，使结晶物充分溶解。用酶联免疫监测仪在490 nm的波长下测定每孔吸光度OD值，计算结果并按公式计算细胞生长抑制率：生长抑制率(%)=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。所有实验均重复3次后取平均值。IC50利用SPSS 23.0计算。

2 结果与讨论

2.1 合成

丹皮酚与1,4-二溴丁烷合成中间体2-(4-溴丁烷氧基)-4-甲氧基苯乙酮(2)的反应，采用丙酮为溶剂，碳酸钾为缚酸剂，反应温度为60 ℃。由于丹皮酚的酚羟基与邻位的羰基会生成分子内氢键，形成稳定的六元环，因而酚羟基上的取代反应变得较为困难，若温度过低，反应很慢。若反应条件稍加剧烈(60～80 ℃)，丹皮酚则易被氧化，且二溴丁烷上的两个活泼溴原子会同时被丹皮酚的酚羟基取代，生成二醚副产物，导致目标产物的收率降低。为降低二醚副产物，实验中加了过量的二溴丁烷。采用氢氧化钠为催化剂时，易发生消除，产生烯烃副产物。

2.1 图谱解析

由4a～4k的IR谱图可知，在2 960 cm-1左右范围内为甲基对称和不对称的伸缩振动峰，在1 620 cm-1左右有C=O的伸缩振动峰，在2 250 cm-1左右有CN的伸缩振动峰，在1 680～1 500 cm-1范围为苯环的骨架伸缩振动峰，1 000～650 cm-1内系苯环上氢的弯曲振动峰。

表 1 化合物的体外抗肿瘤活性

由1H NMR分析(图略)可知，苯环和嘧啶环上的氢的特征峰位于δ6.20～8.00，甲氧基氢的特征峰位于δ3.84左右；苯乙酮上甲基氢的特征峰位于δ2.61附近；嘧啶环上甲基氢的特征峰位于δ2.32～2.36。

2.2 生物活性

测定了丹皮酚嘧啶类化合物4a～4k对HepG2(人肝癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、HCT-116(人结肠癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、LO2(人正常肝细胞)的体外抗肿瘤活性，阳性对照物为抗肿瘤药物顺铂(Cisplatin)，结果见表1。由表1可知，化合物4c和4i对HCT-116抑制活性较高，其IC50值分别为(9.22±1.80)μg/mL、(1.32±0.71)μg/mL，优于阳性对照药。且以上实验，目标化合物对人正常肝细胞LO2的毒性皆小于顺铂。大部分化合物对肿瘤细胞的抑制作用均强于丹皮酚，因此在丹皮酚骨架中引入嘧啶部分，有利于丹皮酚抗肿瘤活性的提高。化合物4c及4i对人结肠癌细胞株HCT-116毒性优于顺铂，值得进一步深入研究。

合成了11种新型的丹皮酚嘧啶类化合物，并对目标化合物进行了初步的抗肿瘤活性测试。结果表明，部分化合物对HepG2、MCF-7、HCT-116、A549肿瘤细胞显示一定的抗肿瘤活性，化合物4i对HCT-116的IC50为(1.32±0.71)μg/mL，显著优于阳性对照药顺铂，具有进一步研究的价值。