氯霉素类检测前处理方法和残留现状探讨——以湖南某市畜禽肉为例

李洪权，周 熙，宋忠祥，付浩华，陈珉珉，唐小鹏*

(1.株洲市食品药品检验所，湖南株洲 412000;2.湖南唐人神肉制品有限公司，湖南株洲 412002)

由于畜禽易发生群体细菌性疾病[1]，因此，为降低发病率，氯霉素类药物被不合理使用的频率也相应增加[2-3]。但是由于氯霉素可引发再生障碍性贫血[4]；氟苯尼考则本身作为兽药，不用于对人疾病的治疗。我国农业部193/235号公告因此而把氯霉素列为畜禽禁用药物，并限定氟苯尼考最高残留量[5-6]。目前畜禽肉中氯霉素类残留检测方法已报道多种[7]，但被纳入国标(GB)作为法定方法的仅有气相色谱-串联质谱法和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[8-9]，而后者常作为检测者的首选方式。本实验组在长期使用后者方法的同时参考多篇文献[10-15]，整理发现，这些方法的前处理步骤可归纳为乙腈/碱化乙酸乙酯提取，正己烷去油脂，浓缩液固相萃取小柱净化三步法。但又有所争议，主要包含两点：提取溶剂的选择，乙腈和碱化乙酸乙酯哪种更好，是否需要经过固相萃取柱净化处理。畜禽群体细菌性疾病的发病还有地域[16]、季节[17-18]等差异，养殖户也可能存在针对性用药。这些畜禽肉中氯霉素类药物残留是否相对应的也存在规律，值得探讨。因此，实验组拟开展两大争议点比较研究，并对不同月份、种类以及区域的样品进行测定和残留规律分析。

1 仪器与试药

1.1 仪器 离心机(ST16R，赛默飞世尔科技有限公司)，旋转蒸发仪(RE-2000B，上海亚荣生化仪器厂)，电子天平(XSE 205DV，梅特勒托利多仪器有限公司)，三重四级杆质谱(QTRAP 4500，上海爱博才思分析仪器有限公司)。

1.2 标准品和试剂 氯霉素标准品(纯度99.8%，批号130555-201203)、氟苯尼考标准品(纯度99.0%，批号C13665000)、氯霉素-D5标准品(纯度99.0%，批号50804AC)均从Dr.Ehrenstorfer公司采购。乙腈、甲醇和正己烷(色谱纯，霍尼韦尔有限公司)。

1.3 样品 畜禽肉均从养殖基地、农贸市场以及大型连锁超市采集并置于-18 ℃冰箱冷冻储存，涉及的畜禽种类包括猪、牛、鸡、鸭(表1)。

表1 畜禽肉样品信息Tab 1 The information of livestock and poultry samples

2 方法与结果[8-9]

2.1 LC-MS/MS方法建立 色谱：Welch Xtimate C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，5 μm)，流动相：水-乙腈(45∶55)，流速：0.5 mL/min。柱温：30 ℃，进样量：5 μL。

质谱：电喷雾电离源(ESI)，负离子扫描，多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)，离子源温度：550 ℃，电喷雾电压：-4500 V，气帘气：35.0 psi，离子源气1：55 psi，离子源气2：55 psi，碰撞气：氩气。其他质谱参数见表2。

表2 氯霉素类化合物质谱优化参数Tab 2 The optimized mass parameters of chloramphenicols

2.2 样品制备方法比较

2.2.1 制备方法一 提取：称取试样2.5 g(精密称定)，置于50 mL离心管中，加入2.0 ng氯霉素-D5和5 mL碱化乙酸乙酯，匀浆1 min，涡旋5 min，超声30 min，离心(7000 r/min)5 min。提取2次，合并上清液至另一50 mL离心管，氮气吹干，3 mL丙酮-正己烷溶解残渣。净化：用3 mL丙酮-正己烷淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将上述残渣溶解溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5 mL丙酮-正己烷洗脱，收集洗脱液于心形瓶中，40 ℃水浴旋转蒸发至近干，氮气吹干，用1 mL水定容，加入1 mL乙腈饱和正己烷，涡旋1 min，离心(7000 r/min)5 min。吸取水层液过0.22 μm滤膜至进样瓶，待测定。

2.2.2 制备方法二 提取：称取试样2.5 g(精密称定)，置于50 mL离心管中，加入2.0 ng氯霉素-D5和5 mL乙腈，匀浆1 min，涡旋5 min，超声30 min，离心(7000 r/min)5 min。提取2次，合并上清液至另一50 mL离心管，加入10 mL乙腈饱和正己烷，涡旋5 min，离心5 min，弃去上层液，下层液转移至15 mL离心管中，氮气吹干，3 mL丙酮-正己烷溶解残渣。净化：同2.2.1项中净化步骤。

2.2.3 制备方法三 省去2.2.2项中固相萃取柱净化步骤，改为“氮气吹干，用1 mL水定容，加入1 mL乙腈饱和正己烷，涡旋1 min，离心(7000 r/min)5 min。吸取水层液过0.22 μm滤膜至进样瓶，待测定”。

2.3 标准溶液和标准曲线的制备 标准溶液：分别精密称取一定质量氯霉素和氟苯尼考，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含氯霉素13 μg和氟苯尼考20 μg的混合标准溶液。并逐级稀释成含氯霉素-D51.0 ng的浓度分别为0.13，0.65，1.30，6.50，13.00，26.00 ng/mL氯霉素和浓度分别为0.20，1.00，2.00，10.00，20.00，40.00 ng/mL氟苯尼考混合标准溶液。

标准曲线：将各个浓度的溶液进样5 μL进行LC-MS/MS分析。以氯霉素和氯霉素D5质量浓度比值为横坐标，质量峰面积比值为纵坐标，计算标准曲线，得氯霉素方程为Y=2.77177X+5.11×e-3，R=0.99956，线性范围为0.13～26.00 ng/mL；同法得氟苯尼考方程为Y=1.27634X+8.4405×e-4，R=0.99968，线性范围为0.20～40.00 ng/mL。

2.4 方法学验证[19]

2.4.1 精密度试验 取同一对照品溶液，按2.1项色谱质谱条件进行测定，重复5次测定氯霉素和氟苯尼考峰面积，两者峰面积RSD(相对标准偏差)分别为0.21%、0.27%，均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取对照品溶液及供试品溶液，于室温分别放置0，2，4，8，10，16，20，24 h，按2.1项色谱质谱条件进行氯霉素和氟苯尼考峰面积测定，对照品中两者峰面积RSD分别为0.77%、0.90%，供试品两者峰面积RSD分别为0.66%、0.96%，均小于2%，表明对照品及供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 精密称取同一批畜禽肉样品6份，按2.2项中比较后最佳前处理方法处理并按2.1项方法进行氯霉素和氟苯尼考峰面积测定，并分别计算RSD。重复性试验：氯霉素和氟苯尼考峰面积RSD分别为1.12%、1.03%，表明本实验方法重复性良好。

2.4.4 加标回收 分别精密称取同一批次的畜禽肉末，精密称取2.5 g，称取6份，每份精密加入氯霉素和氟苯尼考混标溶液(氯霉素：0.13 mg/mL，氟苯尼考：0.20 mg/mL)。按2.2项中比较后最佳前处理方法处理并按2.1项方法进行测定计算回收率，并分别计算回收的RSD，结果如表3所示。

表3 畜禽肉中氯霉素类添加回收试验结果(n=6)Tab 3 The recovery of chloramphenicol from livestock and poultry meat(n=6)

2.4.5 检出限和定量限 根据限量要求，对畜禽肉加标回收试验，当添加氯霉素为某一浓度，定量离子信噪比S/N=3±0.3，此时检出量为检出限；当添加氯霉素为某一浓度，定量离子信噪比S/N=10±1，此时检出量为定量限。同法测定氟苯尼考检出限和定量限。结果表明，当添加氯霉素浓度为0.065 μg/kg时，定量离子信噪比S/N=3.2，当添加浓度为0.2 μg/kg时，定量离子信噪比S/N=10.2，得氯霉素的检出限和定量限分别为0.065 μg/kg和0.2 μg/kg。同法得氟苯尼考检出限和定量限分别为0.1 μg/kg和0.3 μg/kg。

2.5 残留量测定和数据分析结果 对照品与供试品溶液各进样5 μL进行LC-MS/MS分析，试验数据采用multiquant软件按内标峰面积法计算氯霉素和氟苯尼考的含量，如表4所示。采用Excel 2010对数据进行整理和分析，以及SPSS 18.0中Duncan′S对不同分类参数结果进行两两比较，如表5所示。

表4 样本中氟苯尼考检测结果Tab 4 Test results of florfenicol in samples

续表

表5 不同品种、不同月份、不同区域检出值Duncan，S分析结果Tab 5 Results of Duncan，S analysis of detected values in different varieties, months and regions

3 讨论与结论

3.1 前处理方法 实验前期通过比较不同研究者前处理方法差别(表6)，选择从提取溶剂的选择和是否需经过固相萃取柱净化这两个最关键前处理因素入手，以油脂去除能力和回收率为参考指标确定了最佳提取方案。

3.1.1 提取溶剂选择 基于油脂等杂质的带入差异，比较碱化乙酸乙酯和乙腈两种提取溶剂。经2.2项中2.2.1和2.2.2所述前处理步骤中提取处理后，提取液直接用氮气吹干后对比，相对于乙酸乙酯，乙腈带入油脂更少，如图1中a、b所示；经2.2项中2.2.1和2.2.2所述前处理步骤处理后，相对于乙酸乙酯，乙腈提取残留的油脂等杂质更少，如图2中c、e所示；进一步比较经两者前处理步骤处理后回收率的差异，乙腈提取回收率高于乙酸乙酯提取(表7)。因此，提取溶剂建议选择乙腈。

3.1.2 是否需要经固相萃取柱净化处理 结果显示，经2.2项中2.2.2和2.2.3所述前处理步骤处理后，两者去油效果相当，如图2中d、e所示。进一步比较两者回收率差异后，发现未经固相萃取柱净化处理的样品回收率相对过柱处理更接近100%(表7)，这也使得检测值更接近真实值。另外，由于固相萃取技术操作繁琐，以及经丙酮-正己烷溶液脱液[8-9]，仍然能够带入一部分油脂，净化效果相对于不经过固相萃取处理并不明显。而且，经过过柱前三步处理(乙腈提取，氮吹前后的乙腈饱和正己烷萃取)后，去除油脂能力与过柱相当。因此，建议可不经过柱净化处理。

综上所述，最终确定2.2.3制备方法三项为最佳制备方法。

图1 不同溶剂提取Fig 1 Extraction with different solvents

图2 不同溶剂净化方式Figure 2. Cleaning methods with different solvent

表6 畜禽肉前处理报道Tab 6 Report on pretreatment of livestock and poultry meat

表7 不同前处理方式回收率测定(n=10)Tab 7 The recovery rates of different pretreatment methods(n=10)

3.2 检测结果

3.2.1 检出率分析 本实验对372批次的样品进行检验，含氯霉素样品检出0批次，含氟苯尼考样品检出60批次，检出率为16.1%，详见表4。

月份差异。3月采集样品39批次，检出14批次；4月采集样品69批次，检出18批次； 5月采集样品66批次，检出12批次；6月采集样品60批次，检出6批次；8月采集样品17批次，未检出；9月采集样品14批次，检出1批次；10月采集样品15批次，检出2批次；11月采集样品21批次，检出2批次；12月采集样品29批次，未检出。不同月份检出批次在总372批次、所有检出的60批次及该月采集批次中占比如图3所示。由图3可知，根据检出批次在该月中占比的检出率高低排序为3月>4月>5月>10月>7月>6月>11月>9月>8月=12月。

图3 不同月份氟苯尼考检出率Fig 3 The detection rate of florfenicol in different months

品种差异。鸡肉采集样品168批次，检出26批次；牛肉采集样品58批次，检出3批次；猪肉采集样品62批次，检出16批次；鸭肉采集样品84批次，检出15批次。不同品种的肉在总372批次、检出60批次及本品种中占比如图4所示。由图4可知，检出批次在该品种中占比的检出率高低排序为猪肉>鸭肉>鸡肉>牛肉。

区域差异。东区采集样品128批次，检出28批次；南区采集样品112批次，检出15批次；西区采集样品72批次，检出12批次；北区采集样品18批次，未检出；县区采集样品42批次，检出5批次。检出批次在总372批次、检出60批次及本区域中占比如图4所示。由图4可知，检出批次在该区域中占比的检出率高低排序为东区>西区>南区>县区>北区。

图4 不同品种和地区氟苯尼考检出率Fig 4 The detection rate of florfenicol test of different varieties and regional

3.2.2 检出值分析 氟苯尼考检测结果中，含量小于0.1 μg/kg有7批次，占比11.7%；含量为0.1～1.0 μg/kg有38批次，占比63.3%，含量大于1.0 μg/kg有15批次，占比25%，并且有5批次接近或远大于10.0 μg/kg，如表4所示。对检出值的不同品种、不同月份、不同区域进行Duncan′S分析，结果如表5所示。

结果显示，不同品种的检出量平均值大小依次排序为牛肉>鸡肉>猪肉>鸭肉，且品种之间进行Duncan′S分析，两两比较，无显著性差异(P>0.05)。另外，不同月份之间为5月>4月>3月>7月>6月，不同区域间为西区>东区>南区>县区，两两比较，均无显著性差异(P>0.05)。

虽然两两比较在统计学上无明显差异，但是，仍然可以从表4和表5整理的数据中发现部分趋势。在不同月份比较中，3、4、5月平均值呈递增趋势，且5月为7月的8倍，为6月的17倍，显示出明显差异。另外，所有检出值超过1.0 μg/kg的批次中，3月占5批次，4月占4批次，五月占3批次。其他月份中，9月检出1批次，10月和11月检出2批次。总体而言，5月残留最为严重。

不同品种中，直接从数值上看，牛肉检出值最高，为鸭肉的10倍以上，但是进一步分析发现，牛肉检出批次只有3批次，其中有1批次检出值高达15.7894 μg/kg，对平均结果贡献值过大。其余的品种中，鸡肉的平均值为猪肉的2.5倍，为鸭肉的近10倍，显示出明显差异。另外，所有检出值超过1.0 μg/kg的批次中，鸡肉占9批次，比另外3个品种总和的6批次还多，说明鸡肉的检出值相对其他品种较高。

不同区域中，西区检出平均值超过东区的2倍，超过南区的5倍，超过县区的10倍。另外，所有超过1.0 μg/kg的批次中，东区占10批次，其他区占5批次，说明东、西两区均残留严重。

综上所述，对收集的372个批次的样品进行检测，氯霉素为未检出。氟苯尼考检出率中不同月份，明显3、4、5月份的检出率高于其他月份；不同采集地区中，东区检出率最高，超20%；不同品种，猪肉检出率最高，超过20%。检出值中，63.3%的样品检出值位于0.1～1.0 μg/kg之间。进一步对不同因素进行SPSS-Duncan′S分析，结果显示无显著性差异(P>0.05)。