超高效液相色谱结合亲水相互作用色谱法测定注射液中普鲁卡因和青霉素的含量

吴剑平，姜芹，王博，严凤，张文刚，黄士新

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

普鲁卡因青霉素，其化学名为对氨基苯甲酰基2-(二乙氨基)乙酯(6R)-6-(2-苯基乙酰氨基)-青霉烷酸盐一水合物[1]，分子式为：C13H20N2O2·C16H18N2O4S·H2O，CAS No：54-35-3。其属于内酰胺类抗生素，是在青霉素G 的基础上研制出来的下一代长效青霉素，其克服了青霉素G 作用时间短的缺点，主要用于革兰氏阳性菌感染，亦用于放线菌及钩端螺旋体等感染。在兽医临床领域，普鲁卡因青霉素作为使用最广泛的治疗乳牛乳腺炎、阴道炎和其他疾病的抗生素，获得了良好的疗效[2-3]。目前《中国兽药典》二一五年版一部、《美国药典》USP36-NF31及《英国药典》2013年版兽药卷收载了该产品[4-6]。根据兽药典办[2012]9号文件，按中国兽药典办的任务要求，曾于2015年对拟收载于《中国兽药典》二一五年版一部的普鲁卡因青霉素注射液进行了质量标准复核工作，对其中有关该产品各项目技术指标及检测方法进行了验证，并作了进一步的修订[7]。随着检测技术的进步，超高效液相色谱(UPLC)正日益普及，其相比于传统液相色谱具有分离效率高，分析速度快，溶剂消耗小等优点[8-11]。亲水相互作用色谱(HILIC)在分析极性化合物时比传统反相色谱更高的保留能力，可运用在强极性化合物的色谱分析中[12-15]。在实际检测普鲁卡因青霉素注射液过程中发现一些问题有待解决：①由于其剂型为无菌油混悬液，对含量测定项下的精密量取一定体积较为不便； ②普鲁卡因和青霉素为强极性化合物，两者保留差异较大导致单针分析时间过长；③由于普鲁卡因方法所使用流动相中含有高比例盐和离子对试剂，对色谱柱损害较大。上述这些问题可以通过UPLC结合HILIC方法解决。

1 材料和方法

1.1 仪器 UPLC H-Class超高效液相色谱、Empower2控制软件、eλ-PDA紫外二极管阵列检测器等(Waters, 美国)、高速冷冻离心机(Allegra X-22R，BECKMAN COULTER)；电子天平(AL204，梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 材料、药品与试剂 青霉素对照品(中国兽医药品监察所，批号：K0251509，93.6%)，普鲁卡因对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100424-201102，99.8%)，普鲁卡因青霉素注射液(某兽药生产企业，规格：10 mL：300万单位，批号：190902-1，190902-2，190902-3，190902-4，190902-5)甲酸铵(分析纯)，甲酸、乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、石油醚(色谱纯)；去离子水(电阻率≥18 MΩ·cm)。

1.3 色谱条件色谱柱 HILIC分析柱(Thermo AccucoreHILIC100×2.1mm，2.6 μm)，柱温：30 ℃，流速：0.3 mL/min,进样量：5μL，流动相：A为0.05 mol/L甲酸铵(用甲酸调节pH=4.00)，B为乙腈，A∶B=10∶90等度洗脱，紫外二极管阵列检测器测试235 nm波长处吸收。

1.4 前处理条件精密量取 1.00 mL样品置于150 mL分液漏斗中，另准备10 mL石油醚将移液管上挂壁液体全部清洗转移至该分液漏斗，加入10 mL甲醇，充分震摇1 min，静置分层后收集下层液于50 mL容量瓶中。再次加入10 mL甲醇重复上述操作，将下层液体合并于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度并摇匀。精密量取5.00 mL瓶中溶液置100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀后吸取适量过0.22 μm尼龙滤膜后装入棕色进样瓶上机测定。

2 结果与分析

2.1 色谱系统适用性结果 取含青霉素 160 μg/mL、普鲁卡因200 μg/mL的标准品溶液5 μL上机测定235 nm波长处吸收，所获色谱图如图1所示，其系统适应性参数如下表1所示。实验结果表明，该色谱条件下青霉素与普鲁卡因均能满足中国兽药典2015年版一部通则0512高效液相色谱法系统适用性试验下相应要求。

表1 色谱系统适用性试验结果Tab 1 Results of the chromatographic system suitability test

(a) 对照品 Standard；(b)样品 Sample图1 超高效液相色谱图Fig 1 Chromatography by UPLC

2.2 线性定量范围 取青霉素和普鲁卡因对照品适量，用流动相溶解并稀释至每1 mL中分别含青霉素1600 μg/mL和普鲁卡因2160 μg/mL的标准品中间溶液，用流动相稀释至含青霉素40、80、160、400、800 μg/mL标准工作曲线溶液，其中含普鲁卡因分别为 54、108、216、540、1080 μg/mL。按1.3项色谱条件进样检测，将所得色谱图积分面积以Y表示，进样浓度以X表示，所得回归曲线如下表2所示，其线性相关系数r都大于0.999。实验结果表明，该方法在供试品青霉素含量40～800 mg/mL，普鲁卡因含量50～1000 mg/mL内线性关系良好(表2)。

表2 普鲁卡因青霉素标准曲线Tab 2 Standard curve of procaine benzylpenicillin

2.3 方法准确度与精密度 精密量取取供试样品20份，其中5份作为本底样品直接按1.3项和1.4项方法进行检测获得样品的本底含量，剩余15份分成3批，每一批为一个添加含量水平，进行添加回收实验，其中一批添加青霉素128 mg，普鲁卡因86.4 mg；其中一批添加青霉素160 mg，普鲁卡因108 mg；剩余一批添加青霉素192 mg，普鲁卡因 129.6 mg,取5批样品进行上述实验。分别按1.3项和1.4项实验条件进行检测后将结果扣除本底中的青霉素与普鲁卡因含量后计算回收率，所得结果如表3所示。实验结果表明，其添加回收率在92%～105%，RSD<3%，满足中国兽药典2015年版一部通则9101兽药质量标准分析方法验证指导原则中准确度与精密度项下相关要求。

表3 方法准确度与精密度Tab 3 Accuracy and precision of the method

2.4 溶解液与提取液的比较试验结果 尝试了多种不同极性溶解溶液，包括纯乙腈、乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、正己烷和石油醚溶解样品。分别精密量取1.00 mL样品，以上述溶解液清洗移液管并转移至分液漏斗中，分别添加青霉素160 mg，普鲁卡因108 mg，之后采用1.4项中前处理条件进行净化，测得结果如表4。比较了水、甲醇、乙腈、异丙醇的提取效率分别以上述4种提取液分次提取后稀释定容，上机测定，测得结果如表5。实验结果表明，石油醚在进行溶解和转移样品时具有更好的溶解性且回收率最高，因此，选择石油醚来溶解、转移样品和除去助剂；甲醇在进行提取时回收率最高，因此，选择甲醇作为提取剂。

2.5 与原药典方法比较结果 以市售某公司实际生产的普鲁卡因青霉素注射液产品(规格：10 mL：300万单位，批号：190902-1，190902-2，190902-3，190902-4，190902-5)为样品，分别使用本方法与《中国兽药典2015版一部》普鲁卡因青霉素注射液含量测定项下方法进行5次重复检测后进行比较，结果如表6所示，两种方法所获结果的RSD<3%，符合9101兽药质量标准分析方法验证指导原则，结果一致。

表4 溶解液比较Tab 4 Comparison of the solution

表5 提取剂比较Tab 5 Comparison of the extract

表6 方法比较(n=5)Tab 6 Comparison of the methods (n=5)

3 讨论与结论

3.1 溶解液与提取液的优化过程 由于普鲁卡因青霉素注射液为无菌油混悬液，其在常温下粘度较高，移液管上的油液不易完全被转移，原方法用称取一定重量后测算比重，最后换算成体积的方式进行，该方式需要用到大量样品溶液，且由于液体黏度大比重瓶不易清洗。通过查阅相关资料可知[5-6]，普鲁卡因(LogP=2.10)和青霉素(LogP=1.46)属于极性较大的化合物，在极性较小的溶解液中几乎不溶，而在极性较大的有机试剂中溶解性很好，故本方法拟用足量弱极性溶剂充分溶解油液并将移液管上的油液完全清洗转移至分液漏斗中，再用强极性提取液充分提取其中的普鲁卡因青霉素后稀释定容来解决前述问题。本研究尝试了多种不同极性溶解溶液，包括纯乙腈、乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、正己烷和石油醚溶解样品，获得了2.4项中实验结果，证明石油醚在进行溶解和转移样品时具有更好的溶解性且回收率最高，因此选择石油醚来溶解、转移样品和除去助剂。而普鲁卡因和青霉素因极性较大，需用强极性溶剂提取后进行测定，比较了水、甲醇、乙腈、异丙醇的提取效率，获得了2.4项中实验结果，证明甲醇在进行提取时回收率最高，因此，选择甲醇作为提取剂。

3.2 亲水相互作用色谱法在分析普鲁卡因和青霉素时的优势 亲水相互作用色谱(HILIC)的保留机制比较复杂，主要有分配机制和吸附机制(包括氢键作用、偶极间作用等)，还涉及静电作用和离子交换等。普鲁卡因(LogP=2.10)和青霉素(LogP=1.46)都属于极性较大的化合物，在反相色谱柱上难以保留，因此，原药典方法选择氢氧化四丁基铵作为离子对试剂以加强对目标化合物的保留，但使用离子对试剂对色谱柱的使用寿命和方法的耐用性具有负面影响，且不可作为液质联用检测使用的流动相，不利于方法的拓展。因此，在建立新方法时考虑到这些因素改用HILIC方法，对普鲁卡因和青霉素都具有良好的保留，色谱系统适应性参数也符合药典相应要求[4]。另外，HILIC法进样溶剂一般为高比例有机试剂，这和样品前处理中溶解液、提取液和稀释液性质更接近，不必像反相色谱那样再做溶剂置换，这降低了操作中引入的误差，有利于方法的精密度。

本研究建立了UPLC结合HILIC法测定注射液中普鲁卡因和青霉素含量的方法。精密量取样品，以石油醚充分洗涤转移和溶解样品，以甲醇提取后经乙腈稀释后进样测定。实验结果表明，该方法在定量范围内线性关系良好(r>0.999)，其添加回收率在92%～105%，RSD<3%，表明该方法具有较好的准确度与精密度。通过与《中国兽药典2015版一部》普鲁卡因青霉素注射液含量测定项下方法所测得结果的比较，结果一致。