氟苯尼考光学异构体的分离测定方法研究

2021-09-10王宇王炎叶晶晶章玉华曾琴

化工管理 2021年24期

王宇，王炎，叶晶晶，章玉华，曾琴

(浙江海翔川南药业有限公司，浙江台州 318000)

0 引言

氟苯尼考（Florfenicol）又称氟甲砜霉素，化学名[R-(R*,S*)]-2,2-二氯-N-[1-(氟代甲基)-2-羟基-2-[4-(甲磺酰基)苯基]乙基]乙酰胺，是目前常用的一种兽用光谱抗菌药，特点是抗菌谱广、吸收良好、体内分布广泛、抑菌作用强，最小抑菌浓度（MIC)低，抗菌效果是氯霉素、甲砜霉素的15～20倍，饲料给药后60分钟，组织中药物浓度可达峰值，能迅速控制病情，有安全性高、无毒、无残留等特点。没有潜在致再生障碍性贫血的隐患，适合规模化大型养殖场使用，主要用于治疗巴斯德氏菌和嗜血杆菌引起的牛呼吸道疾病。对梭杆菌引起的牛腐蹄病有较好疗效。亦用于敏感菌所致的猪、鸡传染病及鱼的细菌性疾病。

氟苯尼考化学结构中有两个手性中心，因此存在4种分子异构体，但在实际生产中，通过控制合成工艺可得到两个光学异构体即为氟苯尼考（如图1所示）和氟苯尼考光学异构体（如图2所示）。其中氟苯尼考左旋体构型（1 R,2 S）具有抗菌活性，而氟苯尼考右旋光学异构体构型（1 S,2 R）无活性并对氟苯尼考的活性有一定的抑制作用。因此氟苯尼考光学异构体含量的高低会直接影响氟苯尼考的药效。

图1 氟苯尼考

图2 氟苯尼考光学异构

合成氟苯尼考工艺中，很多公司都是以甲砜霉素为起始原料。本公司是从氟苯尼考环合物开始，经过氟化、水解得到氟苯尼考，在反应过程中残留的氟苯尼考环合物经过水解反应会生成甲砜霉素，且氟苯尼考高温水解过程也有可能脱氟产生甲砜霉素，因此氟苯尼考的工艺杂质中均包含了氟苯尼考光学异构体和甲砜霉素。目前氟苯尼考光学异构体的检测方法主要是运用高效液相色谱法，使用Chiralpak AD-H色谱柱进行检测[1]，该方法能够有效分离氟苯尼考和氟苯尼考光学异构体，但对于氟苯尼考光学异构体和甲砜霉素专属性不强，基本保留时间相同，使检测出的氟苯尼考光学异构体含量很不准确。

本研究通过筛选（CHIRALPAK® AD、CHIRALPAK® OD、CHIRALPAK® IA、CHIRALPAK® IB、CHIRALPAK® IC、CHIRALPAK® AY）六种不同手性色谱柱，及调节10种不同溶剂比例（正庚烷与醇溶剂混合、正己烷与醇溶剂混合等）筛选与开发得到一种可以有效分离氟苯尼考、氟苯尼考光学异构体、甲砜霉素杂质的检测方法，并且对方法的专属性、线性、精密度、回收率、定量限度进行方法学验证，相关数据均良好。

1 方法与结果

1.1 仪器与试剂

Agilent 1 260 液相色谱仪，包括G4 212 B二极管阵列紫外检测器；CHIRALPAK® IC手性柱（4.6×250 mm,5 um,日本大赛璐）；OpenLAB Chemstation工作站。正己烷（默克）、正庚烷（默克）和乙醇（默克）均为色谱纯。

1.2 标准品及样品

氟苯尼考供试品（本公司制备）；氟苯尼考标准品、氟苯尼考光学异构体标准品和甲砜霉素标准品（均为本公司制备，并已进行标定，化学纯度99.0%以上）。

1.3 色谱条件

色谱柱：Chiralpak IC, 5 µm, 250×4.6 mm；流动相为正已烷：乙醇=870：130（v/v）；流速为1.0 mL/min；柱温为25℃；紫外检测波长为225 nm；进样量为10 μL，稀释液为乙醇。

1.4 溶液的制备

氟苯尼考标准品溶液：称取30 mg氟苯尼考置于50 mL容量瓶中，用乙醇稀释至刻度作为储备液A。氟苯尼考光学异构体标准品溶液：称取30 mg氟苯尼考光学异构体置于50 mL容量瓶中，用乙醇稀释至刻度作为储备液B。甲砜霉素标准品溶液：称取30 mg甲砜霉素置于50 mL容量瓶中，用乙醇稀释至刻度作为储备液C。

1.5 方法学验证

1.5.1 专属性

分别从储备液B和储备液C中各移取1 mL至盛有40 mg氟苯尼考标准品的50 mL容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度。依条件进样，结果如图3所示。相邻峰之间的最小分离度为1.68，分离效果良好。氟苯尼考光学异构体拖尾因子为1.07、理论塔板数为8 068；氟苯尼考拖尾因子为1.15、理论塔板数为7 685；甲砜霉素拖尾因子为1.45、理论塔板数为6 294。

图3 分离度图谱

1.5.2 线性

分别从储备液A、储备液B和储备液C中各移取2 mL于50 mL容量瓶中，用乙醇稀释至刻度为储备液D。从储备液D中分别移取1 mL、2 mL、5 mL、8 mL、10 mL和12 mL至100 mL容量瓶中，配置成标准溶液进样，记录色谱图，结果显示氟苯尼考光学异构体、甲砜霉素和氟苯尼考在0.24～3.6 μg/mL的浓度范围内，其峰面积对其浓度呈良好线性关系，线性系数分别为r=0.999 97，r=0.999 99，r=0.999 72。

1.5.3 系统精密度

配制1%的供试品溶液为对照溶液。连续进样6次，记录色谱图，氟苯尼考主峰 RSD为0.37%。表明该方法系统精密度良好。

1.5.4 回收率（准确度）

取对照溶液连续进样6针，供试品溶液连续进样3针。分别从储备液B和储备液C中各移取2 mL于50 mL容量瓶中，用供试品溶液稀释至刻度为储备液E；从储备液E中分别移取8 mL、10 mL和12 mL至100 mL容量瓶中，配置成质量浓度分别为，1.92 μg/mL、2.4 μg/mL和3.6 μg/mL的回收率溶液，每个浓度进样3针，记录色谱图，氟苯尼考光学异构体和甲砜霉素的回收率分别为92.9%～96.3%和93.4%～97.7%。方法准确度良好。

1.5.5 定量限度（LOQ）

进样0.24 ug/mL的杂质溶液6针，记录色谱图，测定信噪比。氟苯尼考光学异构体和甲砜霉素信噪比最小值分别为14.0和15.3，峰面积的RSD%分别为2.3%和4.4%。所以该优化条件下氟苯尼考光学异构体和甲砜霉素的定量限浓度均为0.24 ug/mL。

1.5.6 检测限度（LOD）

取3 mLLOQ溶液用稀释液定容至10 mL，进样并记录色谱图，测定信噪比。氟苯尼考光学异构体和甲砜霉素信噪比最小值分别为4.7，4.2。所以该优化条件下氟苯尼考光学异构体和甲砜霉素的检测限浓度均为0.072 μg/mL。

1.5.7 供试品测定

优化条件下，检测3批氟苯尼考供试品。按照1%主成分自身对照法计算供试品中氟苯尼考光学异构体的含量，3批氟苯尼考供试品中氟苯尼考光学异构体的含量均小于0.3%。