蒲公英提取物联合多种抗生素对奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的体外协同抑菌实验

魏秀丽，李晴，徐恩民，张秀英，杨志昆，张志宾，李有志*

(1.山东省兽药质量检验所，山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室， 动物源细菌耐药性监测与精准化用药山东省工程实验室，山东省动物用中药制剂工程实验室，济南250022； 2.日照市莒县畜牧兽医局，莒县276500； 3.中国兽医药品监察所,北京100081；4.河北冀中药业有限公司，石家庄071500)

抗生素是目前我国畜牧业中使用最广泛和最重要的抗感染药物,在控制畜禽的传染性疾病和提高畜禽的生产性能方面发挥了巨大的作用.抗生素一方面具备重要的医用价值,另一方面如兽用抗生素使用不当,出现滥用现象,会给禽畜个体及畜牧产业带来众多问题[1].蒲公英为菊科植物蒲公英、碱地蒲公英或同属数种植物的干燥全草。味甘、微苦，性寒，无毒，用于疔疮肿毒、乳痈、咽痛、湿热黄疸、热淋涩痛，药材及相关制剂被收录于中华人民共和国药典和兽药典[2-4]。由于其良好的治疗效果和经济性，蒲公英提取物在兽药中的研究也成为焦点，但据文献报道不同来源产地的蒲公英其有效成分差异很大，其中以咖啡酸、菊苣酸、单咖啡酰酒石酸等为代表成分，进行液相色谱含量测定，进行定量控制成为必然[5-8]。

奶牛乳房炎是奶牛常见多发病,也是对奶牛生产危害性最大的一种疾病.据报道,临床乳房炎占奶牛总发病率的19%～21%,在闽南农村以个体散户分散饲养为主的奶牛发病率达23%～26%,兽医临床中奶牛隐性乳房炎难以发现,更难治疗,特别是治疗过程中由于使用抗生素和化学药品,在牛奶中形成药残,直接威胁人类健康安全,所以,寻求一种安全、高效、方便、廉价而又无药残的药物,已成为当务之急。随着临床奶牛乳房炎治疗应用乳房注入剂的增多，会呈现不同程度的耐药性，采用浦公英配合治疗奶牛乳房炎，取得良好的效果，关于蒲公英治疗奶牛乳房炎的报道也日渐增多[9-10]。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 耐药性金黄色葡萄球菌(金Z、金4、金5、金C、金L、金6、金F、金I、金2、金D)及其质控菌ATCC18036由中国兽医药品监察所提供。

1.2 主要仪器 分析天平(感量0.00001g)； Waters 2695超高效液相色谱仪；布兰德移液器(10 μL、200 μL、1000 μL)；8道布兰德电动移液器(30-300 μL)；动物源细菌耐药性药敏检测板(上海佰星生物技术有限公司)；培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；高压灭菌锅(日本 CL-32L)；超净工作台(苏州净化)；麦氏比浊仪(法国梅里埃)。

1.3 药品及试剂 菊苣酸对照品(批号111752-200902)；咖啡酸对照品(批号110885-201703)；

单咖啡酰酒石酸对照品(批号18101022)；

蒲公英提取物(北京生泰尔科技股份有限公司小试产品、河北冀中药业有限公司小试产品、东北大兴安岭格林格贝寒带生物科技股份有限公司小试产品)。

抗菌药物原料(阿莫西林、氨苄西林、头孢噻呋钠、头孢喹肟、利福昔明、硫酸庆大霉素、金霉素、盐酸多西环素、恩诺沙星、氟苯尼考)为国内兽药企业提供。

金黄色葡萄球菌显色培养基、LB琼脂、MH肉汤，均购自北京路桥公司。

1.4 高效液相色谱仪测定蒲公英提取物主要成分及含量

1.4.1 液相色谱测定用中药提取物的配制 称取三种来源的蒲公英提取物溶解并定容于10 mL 50%的甲醇中过滤，终浓度为1 mg/mL；

1.4.2 液相色谱条件 色谱柱：C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相A：水(0.4%磷酸)；流动相B：乙腈，进行梯度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：35 ℃，进样室温度10 ℃。二极管阵列检测器，检测波长为330 nm。液相色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件表Tab 1 Gradient elution condition table

1.5 多种抗生素对金黄色葡萄球菌的MIC值测定

1.5.1 药敏试验药物的配制 将所需抗菌药物按照试验需要配制成适当浓度的储备液，所有药物储备液过滤除菌，-20 ℃保存。

1.5.2 菌液的制备 将培养好的菌落，用灭菌肉汤稀释至0.5麦氏单位。取适量菌液用灭菌肉汤培养基进行100倍稀释，菌悬液浓度约为1.5*106CFU/mL,备用。

1.5.3 金黄色葡萄球菌MIC测定 采用微量肉汤稀释法进行测定[11]。

1.6 棋盘法联合药敏试验 选取金黄色葡萄球菌金4作为后续联合用药试验菌株。

(1)将各种药物原液按512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL标准，用MHB营养肉汤依次倍比稀释梯度。

(2)取出灭菌的96孔板，采用棋盘法，在96 孔板的横列和纵列中将不同浓度的2 种药物加入50μL，不同浓度组合的2种药物混合液置于各孔中。

(3)在加药的96孔板的每个孔里加入100 μL稀释好的106CFU/mL金黄色葡萄球菌悬液，然后放入37 ℃温箱中，12～14 h后观察结果，用肉眼观察每个孔的浑浊度，计算统计联合用药的效果。

(4)重复三次棋盘试验[12]。

1.7 计算部分抑菌浓度指数FIC 联合药敏试验结果浓度(Fractional inhibitory concentration index，FIC)指数作为联合药敏试验的判断依据，计算公式如下：

其中FIC ≤ 0.5为“协同作用”；0.5

2 结果与分析

2.1 不同来源蒲公英提取物的含量测定 结果，见表2，图1-图5。

表2 不同来源蒲公英提取物含量Tab 2 Contents of Dandelion extracts from different sources

图1 约40 μg/mL单咖啡酰酒石酸对照品色谱图Fig 1 Chromatogram of about 40 μg/mL mono caffeinated tartaric acid reference substance

图2 约20 μg/mL绿原酸、咖啡酸、60 μg/mL菊苣酸对照品色谱图Fig 2 Chromatogram of 20 μg/mL chlorogenic acid, caffeic acid and 60 μg/mL cichoric acid reference substance

图3 蒲公英提取物(河北冀中)液相色谱图Fig 3 HPLC of dandelion extract (Jizhong, Hebei)

图4 蒲公英提取物(东北)液相色谱图Fig 4 HPLC of dandelion extract (Dongbei)

图5 蒲公英提取物(北京生泰尔)液相色谱图Fig 5 HPLC of dandelion extract (shengtai'er of Beijing)

2.2 体外抑菌实验MIC测定 根据蒲公英提取物成分及含量测定结果，选取河北冀中的蒲公英提取物进行体外药敏试验。对10株金黄色葡萄球菌的体外抑菌实验MIC测定结果见表3。

表3 多种药物对10株金黄色葡萄球菌体外抑菌实验结果Tab 3 In vitro antibacterial test results of various drugs on 10 strains of Staphylococcus aureus

2.3 联合用药对金黄色葡萄球菌药敏试验联合用药指数(FIC)结果表

表4 联合用药对金黄色葡萄球菌联合用药指数Tab 4 FIC value of Staphylococcus aureus in combination

从表中看出，蒲公英提取物与7种药物联合应用，都具有很好地协同作用，能大幅度地抗菌药的抑菌浓度，减少用药量，给中西药联合应用推荐抗菌药减量化应用提供了理论依据。

3 讨论与结论

兽用抗生素是目前我国畜牧业中使用最广泛和最重要的药物,在防控畜禽疫病和提高畜禽生产性能方面功不可没,但它的不当使用,也对公共卫生造成了极大的危害[13]。本试验结果可以看出，不同的菌株对不同的药物敏感性差异较大，与奶牛场的用药习惯有关，治疗奶牛隐性乳房炎，有必要提前进行药敏试验来科学精准的应用药物。临床上应用较久的阿莫西林、氨苄西林已经出现了部分耐药菌株，最为敏感的是齐鲁动物保健品有限公司和齐鲁晟华制药有限公司的利福昔明和头孢噻呋、头孢喹肟；单硫酸卡那霉素对金黄色葡萄球菌有的极为敏感，有的非常耐药。还有几种药物并未应用于临床，其耐药性差异较大，例如盐酸多西环素、恩诺沙星、硫酸庆大霉素、金霉素、氟苯尼考等。

兽药行业大发展创新日新月异，不少企业或科研院所研究盐酸头孢噻呋乳膏剂、含蒲公英药材提取物的中药，来治疗奶牛乳房炎[14-17]。现在临床治疗奶牛乳房炎的药物用很多，有硫酸头孢喹肟乳房注入剂、硫酸头孢喹肟乳房注入剂、利福昔明乳房注入剂[18-22]。本试验，可以看出，蒲公英提取物在一定程度上具有抗菌作用，与多种药物联合应用在体外对奶牛乳房炎的主要病原菌具有良好的协同作用，理论能在一定程度上减少抗菌药物的使用，从而减少药物残留，缩短弃奶期。但，如何进行中西方的复配，如何优化生产工艺是产品稳定有效，临床效果的实现还需要很多的探索性试验来验证。

另外蒲公英提取物，对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌和杀菌的作用，但体外最小抑菌浓度在78.1～625 μg/mL的范围内，与抗菌药相比，是有些差的，与文献报道的比较一致[23]，但由于中药有对机体整体的调节作用，这种作用也不容忽视，相对于耐药菌而言，有些菌株对蒲公英提取物反而更敏感。