不同厂家十滴水微生物限度检查方法的验证与评价

胡 翮，郭 沛，何 硕，李 昂

（湖南省湘潭市食品药品检验所，湖南 湘潭 411100）

十滴水是生活中常见的祛暑药，由樟脑、干姜、大黄、小茴香、肉桂、辣椒等组方，主要用于伤暑引起的头晕、恶心、腹痛、胃肠不适等[1]449。由于药品的微生物检测结果受多种因素影响，考虑到该类药品本身的抑菌性和不同厂家生产工艺的差异，故建立经过验证适宜的微生物检验方法十分必要。根据2015 年版《中国药典(一部)》的要求，本研究中对5 个不同厂家十滴水的微生物检验方法进行了验证试验，为建立合适的微生物检验方法提供参考，并对不同厂家的产品抑菌性及验证结果予以评价。现报道如下。

1 仪器、试药与菌株

仪器：BL －100G 型立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）；HF－safe －1200LC 型生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；XY600 －1B 型电子天平（常州幸运电子设备公司，精度为0.1 g）；SPX－250 型生化培养箱（天津泰斯特仪器有限公司）；MJX－250B型霉菌培养箱（天津泰斯特仪器有限公司）。

试药：十滴水（A 厂，批号为180318；B 厂，批号为20180106；C 厂，批号为180505；D 厂，批号为180412；E厂，批号为180213）；胰酪大豆胨琼脂培养基（批号为180427），沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号为180912），胰酪大豆胨液体培养基（批号为180820），沙氏葡萄糖液体培养基（批号为180731），肠道菌增菌液体培养基（批号为180813），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号为180627），麦康凯琼脂培养基（批号为180904），麦康凯液体培养基（批号为180820），氯化钠－蛋白胨缓冲液（pH ＝7，批号为180820），均购自北京陆桥公司。

菌株：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa) [CMCC（B）10104]，枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilis)[CMCC（B）63501]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]，黑曲霉菌（Aspergillus niger） [CMCC（F）98003]，大 肠 埃 希 菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，均来自中国医学细菌保藏中心。

2 方法与结果

2.1 常规法验证

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用10 倍0.9%氯化钠溶液稀释成一定浓度的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物，加入3 ～5 mL 含0.05%聚山梨酯80 的无菌0.9%氯化钠溶液，将孢子洗脱。采用适宜的方法吸出孢子悬液置无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80 的无菌0.9%氧化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

试验组中，以无菌操作取样品10 mL，加氯化钠－蛋白胨缓冲液(pH ＝7.0)稀释至100 mL，制成1 ∶10(V／ V)的供试液，分别取该供试液9.9 mL，加入以上5 种代表试验菌株0.1mL（供试液含菌量不大于100cfu／mL），吸取1 mL，注入平皿中，平行制备2 个平皿，倾注15 ～20 mL 融化并冷却至约45 ℃的琼脂培养基（加入铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的平皿倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；加入白色念珠菌和黑曲霉的平皿倾，注沙氏葡萄糖琼脂培养基），待凝固后置规定温度培养并观察结果。供试品对照组中，取供试液，以相应稀释液代替菌液同试验组操作。菌液对照组中，取相应稀释液替代供试液，按试验组操作方法加入试验菌液，并进行微生物回收试验。结果见表1。

表1 各批样品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数的常规法验证结果（%）

可见，5 个厂家的供试品分别接种5 种试验菌后，需氧菌总数和霉菌酵母菌总数计数的回收率均小于50%，说明产品有抑菌作用，且A，C，D 3 个厂家的抑菌作用更强。因此，调整试验方案，对A，C，D 3 个厂家直接用薄膜过滤法进行验证，对B，E 2 个厂家的微生物计数采用培养基稀释法进行验证。

2.2 培养基稀释法验证

试验组中，分别取B 厂和E 厂的1 ∶10( V／ V)供试液各9.9 mL，加入5 种代表试验菌株0.1 mL（每1 mL供试液中含菌量不大于100 cfu），吸取该供试液0.2 mL注入平皿中，加入15 ～20 mL 营养琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养、观察，并进行菌数计数。供试品对照组中，取制备好的供试液，以相应稀释液代替菌液同试验组操作。菌液对照组中，以相应稀释液代替供试液，按试验组操作方法加入试验菌液，并进行微生物回收试验。结果见表2。可见，使用培养基稀释法仍有部分菌株回收率未达50%。

表2 各批样品需氧菌总数、菌和酵母菌总数计数的培养基稀释法验证结果（%）

2.3 薄膜过滤法验证

试验组中，取适量氯化钠－蛋白胨缓冲液(pH ＝7.0)润湿滤膜，将5 个不同厂家的1 ∶10( V／ V)供试液各9.9 mL 加入滤器中，分别以氯化钠－蛋白胨缓冲液(pH ＝7.0)100，200，300 mL 作为冲洗液，分次冲洗滤膜，在最后1 次冲洗液中加入0.1 mL 不大于100 cfu 的待测菌株，冲洗后取出滤膜，贴于规定的培养基上培养，并观察和计数。供试品对照组中，取1 ∶10( V／ V)供试液10 mL 加入滤器中，分别以氯化钠－蛋白胨缓冲液(pH ＝7.0)100，200，300 mL 作为冲洗液，分次冲洗后，取出滤膜，贴于规定的培养基上培养，并观察和计数。菌液对照组中，取相应稀释液代替供试液，按试验组操作方法加入试验菌液，并进行微生物回收试验。结果见表3。

表3 各批样品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数的薄膜过滤法验证结果（%）

可见，5 个不同厂家的样品经不同体积冲洗液薄膜过滤后，不同菌株之间验证结果存在一定差异。当冲洗量为100 mL 时，各厂家均不能达到规定的回收率，说明样品仍有一定的抑菌作用。当冲洗量为200 mL 时，B 厂样品5 种菌株的回收率均高于50%，说明可用此经过验证的方法用于该厂家的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数，而其他厂家还应适量扩大冲洗量。当冲洗量达到300 mL 时，5 个厂家产品对5 种试验代表菌株的回收率均能达到50%以上。

2.4 控制菌检查方法验证

试验组中，将5 个不同厂家的1 ∶10( V／ V)供试液各9.9 mL 加入滤器中，B 厂的以氯化钠－蛋白胨缓冲液(pH ＝7.0)200 mL 作为冲洗液，A，C，D，E 厂的以氯化钠－蛋白胨缓冲液(pH ＝7.0)300 mL 作为冲洗液，分次冲洗滤膜，在最后1 次冲洗液中加入0.1 mL 不大于100 cfu的大肠埃希菌，冲洗后取出滤膜，贴于规定的培养基上培养并观察结果。阳性对照组中，取相应稀释液代替供试液，按试验组中方法试验，在最后1 次冲洗液中加入不大于100 cfu 的大肠埃希菌，冲洗后取出滤膜，贴于规定的培养基上培养并观察结果。阴性对照组中，取相应稀释液代替供试液，按试验组中方法进行薄膜过滤，但不加菌液，待冲洗完成后取出滤膜，贴于规定的培养基上培养并观察。结果见表4。

表4 大肠埃希菌验证结果

3 讨论

3.1 验证结果

本研究结果显示，常规法和培养基稀释法均不适用于该5 个厂家十滴水的微生物限度及控制菌检查；采用薄膜过滤法后，各厂家的各试验菌的回收率均符合要求。可见，A，C，D 3 个厂家的供试液常规法试验的抑菌作用相对较强，回收率非常低，故直接采用薄膜过滤法。B，E 2 个厂家的供试液经培养基稀释法验证后，有部分菌株不能达到规定的回收率标准，故将5 个厂家的产品均进行薄膜过滤法试验。除B 厂的供试液冲洗量为200 mL时可满足试验要求外，其他厂家的供试液所用稀释液冲洗量均为300 mL 才能去除其抑菌作用。因此，因各厂家的产生环境、制备工艺、原辅料质量及供试品的理化特性等可能存在差异，对微生物限度检查的产品均应进行方法验证，以确认所采用方法适用于该产品的微生物检查。

3.2 验证方法选择

按2015 年版《中国药典(一部)》要求，选择适宜的阳性菌株[1]140，对5 个不同厂家的样品同时进行验证与比较。优先考虑常规法验证，若验证结果不能满足试验要求，对于抑菌作用相对较强的，采用培养基稀释法再验证；而对于抑菌作用很强的，则考虑采用薄膜过滤法来消除其抑菌作用。参考文献[2 －7]进行比较和研究，对试验方案进行设计和调整，文中验证思路和试验方法可对该品种微生物检查方法的验证提供参考，以提高微生物的检出率，更好地控制药品的质量。

3.3 验证过程中应注意的问题

菌液：制备试验菌液时，应提前确定菌液浓度，进行菌数测定，并与试验组菌数测定同时进行，精确测定菌数是回收率测定的关键步骤。由于加入菌液体积较小，对检测结果影响较大，因此必须严格控制菌液加入量，有必要采用商品化的定量菌株[8]。试验要求的加菌量一般不大于100 cfu，以便于计数，菌量太大或太小均可能导致误差增加。

样品：样品的微生物限度检查验证试验应进行3 次独立的平行试验。样品稀释后应混合均匀[9]。此外，采用薄膜过滤法时，冲洗时应分次冲洗，且冲洗量不宜过大，总冲洗量不得超过1 000 mL，以免滤膜上的微生物受损伤[2]。

培养基与培养时间：试验用培养基可按2015 年版《中国药典（四部）》非无菌产品微生物限度检查法中培养基适用性检查项下进行验证试验，以确保检测结果的准确性。此外，在适宜培养条件下，微生物的群体生长数量与培养时间遵循生长曲线规律[10]，处于指数生长期的代谢旺盛，生长迅速，个体形态、生化特征较一致，是微生物检验鉴定的理想状态[11]，尤其当菌落在培养基上不宜辨别时，可适当延长培养时间，有利于微生物的检出[12]。

滤膜：本研究中对比了2 个厂家的不同型号滤膜，发现有的滤膜不能起到很好的过滤作用。因十滴水的主要溶剂为70%乙醇，应充分考虑滤膜材质对溶剂兼容性和滤膜对微生物截留能力的影响。