决明子标准汤剂质量评价研究

陈 萍，郭 冬，杨 锦，薛佩芸

（1. 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046； 2. 陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003）

决明子为豆科决明属植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L. 的干燥成熟种子，味甘、苦、咸，微寒，归肝经、大肠经，具有清热明目、润肠通便的功效[1]。现代药理学研究表明，决明子具有调脂、降血压、保肝、明目、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等功效，是药食同源物质[2－4]。其主要化学成分包括蒽醌类（橙黄决明素、芦荟大黄素、黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等），萘并吡喃酮类（红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷C、橙黄决明素－6－ O－β－D－葡萄糖苷等），脂肪酸类及多糖类等[3－5]。中药标准汤剂作为一种标准物质和标准体系，其质量评价研究可为衡量配方颗粒质量均一性、评价配方颗粒与临床汤剂一致性提供参考[6－11]。本研究中通过制备决明子标准汤剂，并建立特征指纹图谱和多指标成分分析方法评价其质量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪，二极管阵列（DAD）检测器（美国Agilent 公司）；KQ－500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为50 Hz）；BT25S 型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，精度为十万分之一）；CP2102 型电子天平（奥豪斯仪器有限公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

橙黄决明素对照品（批号为111900 －201605，含量为98.3% ），芦荟大黄素对照品（批号为110795 －201710，含量为98.3%），黄决明素对照品（批号为E －2333，含量为98.2%），大黄素对照品（批号为110756 －201512，含量为98.7% ），大黄酚对照品（批号为110796 －201621，含量为99.2%），大黄素甲醚对照品（批号为110758 －201616，含量为99.0%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈，磷酸均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；21批决明子饮片（编号S1－S21，批号见表1）分别产自安徽、河南、广西、云南等地，经陕西省中医药研究院杨智峰教授鉴定为正品。

表1 市售21 批决明子质量考察结果

2 方法与结果

2.1 市售决明子饮片质量考察

根据2015 年版《中国药典（一部）》决明子饮片项下规定，对市售21 批决明子饮片进行质量考察，结果见表1。

2.2 标准汤剂制备

根据国家中医药管理局颁布的《医疗机构中药煎药室管理规范》原则[12]，按表1 依次称取15 批合格决明子饮片各150 g，分别加入8 倍量纯净水，浸泡30 min，沸腾后加热回流30 min，趁热过滤，药渣再加8 倍水，加热回流30 min，趁热过滤，合并滤液，以水定容至2 500 mL，即得1 ～15 号样品，备用。

2.3 标准汤剂中橙黄决明素及大黄酚含量测定[13 －14]

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Welchrom C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）－0.1% 磷酸水溶液（B），梯度洗脱，0 ～15 min 时38%A，15 ～30 min 时38%A －90%A，30 ～40 min 时90%A，40 ～45 min 时38%A；流 速：1.0 mL ／ min；检测波长：284 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。分别取对照品溶液及供试品溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样测定，橙黄决明素和大黄酚的保留时间分别为18.436 min 和31.877 min，各成分色谱峰与相邻峰分离度均大于1.5，理论板数均大于7 800，拖尾因子0.95 ～1.05。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.3.2 溶液制备

取橙黄决明素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，加无水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液制成含橙黄决明素131.65 μg ／mL、大黄酚246.8 μg／mL 的混合对照品母液。精密吸取母液1.5 mL，置10 mL 容量瓶中，以无水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液稀释至刻度，即得对照品溶液。分别精密吸取1 ～15 号标准汤剂各20 mL，加盐酸1.0 mL，置水浴中加热水解1 h，立即冷却，用三氯甲烷振摇提取4 次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣用无水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液溶解，转移至25 mL 容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密量取对照品母液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分别加无水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液定容于10 mL 容量瓶。分别吸取10 μL 注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定，重复2 次。以各成分的峰面积平均值（Y）为纵坐标、对应成分的质量浓度（X，μg／mL）为横坐标绘制标准曲线。结果见表2。

精密度试验：分别取2.3.2 项下对照品溶液及供试品溶液（1 号），按拟订色谱条件分别连续进样6 次。结果对照品溶液中橙黄决明素及大黄酚峰面积的RSD 分别为0.09%和0.12%（n ＝6），供试品溶液中橙黄决明素及大黄酚峰面积的 RSD 分别为0.35% 和0.24%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

表2 橙黄决明素及大黄酚线性关系考察结果( n ＝6)

稳定性试验：取2.3.2 项下供试品溶液（1 号），分别于0，2，4，8，12，20，24 h 时按拟订色谱条件进样测定。结果橙黄决明素及大黄酚峰面积的RSD 分别为0.88%和0.96%（n ＝7），表明供试品溶液24 h 内稳定。

重复性试验：取同一标准汤剂（1 号），依法平行制备6 份供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果橙黄决明素及大黄酚峰面积的 RSD 分别为2.86% 和2.72%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的决明子标准汤剂（1 号）6 份，各2.0 mL，分别加入橙黄决明素及大黄酚对照品贮备液适量，依法制备供试品溶液，定容至5 mL，按拟订色谱条件测定，计算回收率。结果见表3。

2.3.4 样品含量测定

分别精密吸取2.3.2 项下1 ～15 号供试品溶液各10 μL，按拟订色谱条件测定，计算供试品溶液中橙黄决明素和大黄酚的含量。结果见表4。

2.4 决明子标准汤剂出膏率及转移率测定

出膏率：精密量取1 ～15 号决明子标准汤剂各100mL，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于烘箱105 ℃干燥至恒 重，计 算 出 膏 率。 y（% ）＝[（m1／100 × V）／ m2] ×100%（y 为出膏率，m1为干浸膏质量，V 为样品溶液总体积，m2为饮片质量）。结果见表4。15 批标准汤剂出膏率为9.57% ～14.39%，平均（12.32 ±1.35）%。

转移率：计算橙黄决明素及大黄酚转移率。指标成

表4 标准汤剂出膏率、指标成分含量及转移率测定结果（%）

分的转移率（%）＝(标准汤剂中指标成分的含量／饮片中指标成分的含量) ×100%。结果见表4。15 批标准汤剂橙黄决明素转移率为82.93% ～89.53% ，平均（84.92±2.57）%；大黄酚转移率为22.33% ～25.68%，平均（23.82 ±0.97）%。

2.5 HPLC －DVD 特征指纹图谱

2.5.1 色谱条件

同2.3.1 项下色谱条件。

2.5.2 溶液制备

分别称取橙黄决明素对照品、芦荟大黄素对照品、黄决明素对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品及大黄素甲醚对照品，精密称定，加无水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液，制成含橙黄决明素263.3 μg／mL、芦荟大黄素252.0 μg／mL、黄决明素247.8 μg／mL、大黄素247.6 μg／mL、大黄酚246.8 μg／mL、大黄素甲醚201.8 μg／mL 的混合对照品溶液，即得对照品溶液。按

表3 加样回收试验结果（n ＝9）

2.3.2 项下方法制备1 ～15 号供试品溶液。

2.5.3 方法学考察

精密度试验：取2.5.2 项下供试品溶液（1 号），按拟订色谱条件连续进样6 次，色谱图见图2。可见，1 号色谱峰（橙黄决明素）在决明子标准汤剂的制备过程中相对较稳定、含量高、分离度好，故被选作参照峰。色谱图中10 个共有峰的相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RPa）的RSD 小于3% ( n ＝6)，表明仪器精密度良好。详见表5。

稳定性试验：取2.5.2 项下供试品溶液（1 号），于0，2，4，8，12，24 h 时按拟订色谱条件进样测定，色谱图中10 个共有峰RRT 和RPa 的RSD 见表5，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

重复性试验：取同一标准汤剂（1 号），依法平行制备6 份供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。色谱图中10 个共有峰RRT 和RPa 的RSD 见表5，表明方法重复性良好。

2.5.4 指纹图谱测定及特征峰指认

按拟订色谱条件对15 批决明子标准汤剂样品的特征图谱进行测定，以对照品的保留时间和紫外光谱进行特征峰确认，其中决明子的典型色谱图见图2。

2.5.5 相似度评价

将15 批决明子标准汤剂图谱数据导入国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）》。参照图谱设为S0，对照图谱生成方法设为平均数，时间窗宽度设为0.10，多点校正，自动匹配，生成对照，计算相似度。结果见表6。15 批决明子标准煎液的指纹图谱见图3。结果15 批决明子标准汤剂与对照指纹图谱相似度均大于0.9，表明一致性好。

表5 决明子标准汤剂精密度、稳定性、重复性试验测定结果（%，n ＝6）

图2 决明子标准汤剂特征指纹图谱

3 讨论

3.1 质量评价

本研究中主要从饮片质量控制、标准汤剂制备过程、标准汤剂的质量控制3 个方面进行质量评价，其中标准汤剂制备过程严格遵守其标准化操作[12]，所得15 批汤剂平均出膏率为（12.32 ±1.35）%，橙黄决明素平均转移率为（84.92 ±2.57）%，大黄酚平均转移率为（23.82 ±0.97）%。通过建立标准汤剂的橙黄决明素和大黄酚含量测定方法，同时建立标准汤剂特征指纹图谱测定方法，从指纹准确定性和指标成分定量方面达到了对决明子标准汤剂整体质量的评价。

表6 15 批决明子标准汤剂指纹图谱相似度评价结果

图3 15 批决明子标准汤剂的特征指纹图谱

3.2 参数范围确定

以本研究中所建立的15 批决明子标准汤剂各参数均值的75% ～125%计，出膏率为9.24% ～15.4%，橙黄决明素转移率为63.69% ～106.15%，大黄酚转移率为17.86% ～29.78。各项实测值均在标准汤剂参数范围内，表明决明子标准煎液质量均一性好。

3.3 指标成分筛选与评价

出膏率和煎煮时间紧密相关，煎煮90 min 后出膏率含量最高，并趋于稳定。本试验按标准化操作[12]，因此出膏率偏低。按2015 年版《中国药典（一部）》决明子饮片测定橙黄决明素及大黄酚含量的方法，标准汤剂中橙黄决明素提取率高、转移率稳定，能表征提取物的均一性；大黄酚含量较低，可能是由其热不稳定性和（或）煎煮过程中转化为其他黄酮类成分造成，具体原因有待进一步研究，故选用橙黄决明素为质量评价的指标成分。

3.4 指纹图谱分析

开展特征指纹图谱研究时，考虑到应最大限度地检出化学成分，试验选用乙腈－0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，0 ～35 min 时18%→19%乙腈，35 ～55 min 时19%→36%乙腈，55 ～80 min 时36%→85%乙腈，80 ～85 min 时85% 乙腈，85 ～86 min 时85% →18%乙腈[15－16]，各化学成分出峰滞后（55 min 后）。经反复试验，最终选择本试验中的洗脱条件，出峰数量多、保留时间合适。决明子标准汤剂检出10 个特征指纹共有峰，其中4，5，7，8 号共有峰的相对峰面积较大，目前未能指认出，还有待后期进一步研究。