慢性HBV感染不同临床阶段患者外周血T细胞免疫状态的研究

罗雅煊 李婷婷 王嘉悦 秦 波 金艾顺

(重庆医科大学基础医学院免疫学教研室,重庆 400016)

WHO报道，全球大约有2.57亿慢性HBV感染者[1]，中国是HBV感染的高发国家。HBV感染慢性化可导致肝硬化和肝癌，严重影响人们的身体健康[2]。CHI患者病程长久，临床症状多样，根据目前的乙肝防治指南和临床表现，慢性HBV感染被划分为四个不同临床阶段：IT、IA、IC、RA[3-5]。病毒活跃情况与患者免疫状态的关系密切复杂。机体对HBV免疫应答的差异造成HBV感染的不同转归。HBV诱发肝损伤过程中，T细胞免疫应答对病毒清除具有重要的作用[6,7]。虽然文献已经报道有关CHI不同临床阶段患者外周血T细胞亚群分布，但CHI不同临床阶段患者外周血T细胞亚型变化尚不清楚。因此，本研究对外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞亚型与HBV复制状态进行综合分析，同时分析CHI患者外周血CD8+T细胞表面抑制性分子PD-1的表达水平，探寻T细胞亚型变化，对CHI的临床分期诊断以及预测预后和转归可能具有重要意义。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象 选择2019年10月至2020年1月就诊于重庆医科大学附属第一医院感染科的CHI患者28例，同时纳入10名健康志愿者。纳入标准：①所有入选患者均符合2019年《慢性乙型肝炎防治指南》[3]的慢性HBV感染诊断标准；②入选患者近六个月均未接受过任何抗HBV病毒药物或保肝治疗；③患者及家属均知情同意。排除标准：①其他原因如甲乙丙丁和戊型肝炎，药物、酒精等其他原因所致的肝损害；②患者依从性差者。在纳入的28例CHI患者中，男性15例，平均年龄(36.33±12.36)岁；女性13例，平均年龄(37.38±10.91)岁；53.6%的患者检测到超过7 log10 copies/ml的HBV DNA拷贝数，全部为HBeAg阳性；32.1%的患者的HBV DNA拷贝数低于3 log10 copies/ml，全部为HBeAg阴性。参考2019年《慢性乙型肝炎防治指南》、根据研究对象的临床症状，将28例研究对象划分到HBV感染的不同阶段。IT组10例，IA组5例，IC组8例，RA组5例。

1.1.2实验试剂与仪器 流式抗体CD3-PE、CD4-PC5.5、CD8-FITC、CD45RA-APC、CCR7-BV421、CD25-BV650、CD127-APC、PD-1-BV421及同型对照抗体IgG2b-APC、IgG2b-BV421、IgG1-BV650、IgG1-APC、IgG1-BV421均购自Biolegend公司，Lymphopre TM淋巴细胞分离液购自Stemcell公司，RPMI1640培养液购自Sigma公司，达优细胞冻存液购自达科为公司。流式细胞仪Celesta购自BD公司。

1.2方法

1.2.1临床资料的收集 收集患者的临床资料，包括年龄、性别等，由重庆医科大学附属第一医院检验科检测血清ALT、AST、HBV DNA拷贝数、乙肝两对半定量等。

1.2.2血液标本的采集和PBMC的提取 采集研究对象静脉血5 ml于抗凝管中，摇匀，250 g离心10 min，收集血浆，冻存于-80℃冰箱。采用密度梯度离心法提取PBMC。将PBS缓冲液与血细胞按1∶1 比例混合，取等量的淋巴细胞分离液加至混合液底部，400 g离心30 min，收集液面下位于第二层的白色絮状物，即PBMC，PBS缓冲液洗涤，300 g离心5 min，收集细胞并计数，冻存于液氮罐中。

1.2.3流式细胞术检测 检测T细胞亚型频率，实验管加入CD3-PE/CD4-PC5.5/CD8-FITC/CD45RA-APC/CCR7-BV421，同型对照管加入CD3-PE/CD4-PC5.5/CD8-FITC/IgG2b-APC/IgG2b-BV421。检测CD4+CD25+CD127-Treg频率及CD8+T细胞表面PD-1的表达量，实验管加入CD3-PE/CD4-PC5.5/CD8-FITC/CD25-BV650/CD127-APC/PD-1-BV421，同型对照管加入CD3-PE/CD4-PC5.5/CD8-FITC/IgG1-BV650/IgG1-APC/IgG1-BV421。充分混匀，室温避光孵育20 min，清洗重悬，上机检测。

1.3统计学方法 采用统计学软件SPSS20.0 软件和GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析。分类资料采用χ2检验。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。相关性分析采用Pearson线性相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CHI不同临床阶段患者外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞亚群频率分析 与HD相比，CHI中CD3+T细胞频率呈减少趋势，但无显著性差异；CD4+T细胞和CD8+T细胞频率以及CD4/CD8比值均无显著性差异。RA组CD3+T细胞百分比显著降低(P<0.05)，而其他组差异无统计学意义(表1)。提示：CHI中RA期，CD3+T细胞百分比降低，免疫功能低下状态，可能对CHI疾病进展与预后预测具有重要意义。与RA期不同，IA组CD3+T细胞无显著变化，但CD4+T细胞百分比呈减少趋势，而CD8+T细胞百分比呈增高趋势，CD4/CD8比值降低，可能为区分不同免疫状态提供参考价值。

2.2CHI不同临床阶段患者外周血T细胞亚型及其与病毒载量的相关性分析 按功能和分化状态，通常将T细胞可分为Tn、Tcm、Tem和Te。图A显示T细胞各亚型的检测和分析。对于CD4+T细胞亚型，与HD相比，CHI中IT和RA组CD4+Tcm细胞百分比明显增高(P<0.05)(图1B)。对于CD8+T细胞亚型，与HD相比，CHI中IC、RA组CD8+Tn百分比下降(P<0.05)；IT组CD8+Tem百分比下降(P<0.05)，而IC组CD8+Te百分比显著增高(P<0.001)。CHI中，IT、IA、IC、RA组，两两之间比较，与IT组相比，IC组CD8+Tn百分比降低，CD8+Te百分比增高(P<0.05)(图1C)。分析CD8+T细胞各亚型与HBV DNA载量的关系，结果显示相较于高病毒载量组，低病毒载量组的CD8+Tn百分比降低，而CD8+Te百分比显著增高(P<0.05)(图2)；CD8+Tem百分比无显著变化(结果未显示)。提示：病毒载量影响CD8+T细胞亚型百分比。病毒载量结合CD8+T细胞亚型的检测对CHI疾病的分期及预后有参考价值。

与HD相比，CHI中各组患者外周血Treg频率均呈增高趋势，差异无统计学意义(P>0.05)。CHI中IA组Treg频率显著升高，与HD及IC组相比，差异有统计学意义(P<0.01)(图3A)。分析Treg频率与HBV DNA、ALT、AST的相关性，结果显示CHI中Treg频率与ALT、AST呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

图1 外周血T细胞亚型分析Fig.1 Analysis of T cell subsets in PBMCs

2.3CHI不同临床阶段患者外周血PD-1+CD8+T细胞百分比分析 与HD相比，CHI中各组PD-1+CD8+T细胞百分比均显著增高(P<0.05)；CHI中IT、IA、IC、RA组，两两之间比较，IA、IC组PD-1+CD8+T细胞百分比升高最为明显，其次是RA组，与HD相比，有统计学意义(P<0.05)(图3B)。

图2 CD8+T细胞亚型与HBV DNA载量的关系Fig.2 Correlation between CD8+T cell subsets and HBV DNA load

图3 CHI不同临床阶段Treg频率及PD-1+CD8+T细胞百分比分析Fig.3 Analysis of frequencies of Treg and PD-1+CD8+T cells persentage from patients with CHI in different clinical stages

表1 CHI不同临床阶段患者外周血T细胞亚群分析

表2 慢性HBV感染患者Treg频率与HBV DNA、ALT、AST的相关性分析

3 讨论

人体感染HBV后病情严重程度及预后差异与宿主的免疫状态密切相关[8]。其中，T细胞免疫在抗HBV感染中发挥重要作用。受到抗原刺激时，T细胞遵循从Tn向Tcm、Tem、Te等T细胞群体分化的渐进过程[9-11]。抗原类型、抗原量及持续时间及炎症细胞因子环境等多种变化都会影响T细胞的分化水平和效应功能[12,13]。Treg细胞和免疫抑制性分子如PD-1的表达，在CHI中也发挥着重要的免疫调节作用。Treg是一群具有免疫负调节作用的细胞群，能抑制CD4+T细胞对CD8+T细胞的辅助作用，还能通过分泌抑制性细胞因子非特异性抑制CD4+T细胞、CD8+T细胞的活化和增殖[14,15]。PD-1是免疫细胞表面表达的一种抑制性分子。PD-1表达量的增加，一方面能抑制T淋巴细胞增殖和功能，对减轻肝脏的炎症反应，防止肝脏细胞被大量破坏而引起的肝功能衰竭具有积极的作用，另一方面高表达PD-1的CD8+T细胞处于耗竭状态促使HBV感染的慢性化[16]。

与HD比较，CHI患者外周血T细胞亚群的变化，文献报道不一致[17-19]。与Wang等报道一致，我们的研究结果显示，与HD相比，CHI的T细胞亚群无显著差异。因此，CD3+T细胞的百分比对CHI的免疫功能状态评估和参考尚需要大样本分析明确其价值和意义。而在CHI中的RA组CD3+T细胞百分比明显下降，但CD4+T细胞呈上升趋势，Treg频率明显升高；CD8+T细胞百分比变化不显著，但PD-1+CD8+T细胞百分比明显增加。这些提示RA期免疫功能处于抑制状态。因此，CD3+T细胞百分比下降、Treg和PD-1+CD8+T细胞频率升高，为CHI处于RA期诊断提供参考。同时RA期免疫功能处于低下状态，预示疾病发展进程及预后转归不良。

与Gu等[19]报道相符，结果显示，IA组CD4+T细胞百分比呈下降趋势，但Treg频率明显上升，且与ALT水平正相关；CD8+T细胞百分比呈上升趋势，PD-1+CD8+T细胞百分比显著上升；CD4/CD8比值明显减小，提示机体细胞免疫功能处于活跃状态，可能预测肝脏炎症的严重程度。与RA期免疫功能状态不同，IA期CD3+T细胞频率没有明显减少，但是CD4/CD8比值变化明显，这些表明RA期与IA期的免疫功能处于不同状态，临床疾病预后与转归不同。

IT组HBV DNA载量最高，与HD相比，CD8+Tem细胞百分比明显下降。Tem是CHI患者病毒特异性CD8+T细胞的主要T细胞亚型[20]。CD8+Tem细胞百分比的降低提示T细胞免疫功能缺乏和(或)功能不足，是导致CHI患者发生免疫耐受(IT)的重要原因。因此，CD4+Tem和CD8+Tem细胞百分比下降和病毒载量异常升高提示CHI的免疫耐受状态(IT)。我们结果发现低病毒载量的IC组CD8+Te百分比较高，提示CD8+Te清除病毒能力较强的免疫功能状态。因此，低病毒载量结合Te升高提示CHI处于IC期，预测疾病良好的预后和转归。

通常T细胞高表达PD-1，一方面提示T细胞活化状态，另一方面也提示T细胞走向耗竭趋势即免疫功能耗竭。我们的研究显示：CHI组的PD-1+CD8+T细胞频率高于HD，提示病理状态下的免疫功能处于活跃状态清除病毒，病毒载量下降如IA和IC期；另一方面，免疫功能处于抑制状态，病毒大量复制或持续波动状态如IT和RA期。所以，通过PD-1+CD8+T细胞的百分比结合病毒载量可能辅助预测临床免疫状态和临床分期。

虽然，我们的研究未能追踪同一个患者的慢性HBV感染不同临床阶段的免疫状态，同时样本量少尚有待扩大样本深入研究。但我们纳入了CHI不同临床阶段患者，综合分析了CHI患者外周血T细胞、Treg及PD-1的表达变化，在一定程度上能提示疾病进展过程中的T细胞免疫分化情况，对临床了解慢性HBV感染疾病的发展，开展合理的免疫治疗具有重要意义。

总之，我们的研究指出CHI不同临床阶段患者外周血T细胞亚型有显著性差异，低病毒载量的IC组CD8+Te细胞频率显著增高，提示疾病的良好预后转归。CHI中CD8+T细胞表面PD-1的表达量增加，提示机体两种不同的免疫状态，预测疾病不同的免疫转归。Treg频率与机体ALT水平呈正相关，提示可用于预测肝炎疾病的严重程度。联合检测CHI患者T细胞免疫状态，对慢性HBV感染疾病的分期诊断和治疗以及预测预后转归具有重要参考意义。