巨噬细胞来源的TGF-β对小鼠骨髓成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原表达的影响

王 胜 陈永平 吕敬龙 李 颖 刘 林

(重庆医科大学附属第一医院血液科，重庆 400016)

原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis，PMF)是一类慢性骨髓增生性疾病，造血干细胞恶性克隆伴随着继发性的骨髓纤维化和髓外造血[1,2]，其中骨髓纤维化病变通常是由于骨髓成纤维细胞的恶性增殖并产生大量胶原蛋白引起的。PMF发病机制十分复杂[3]，前期研究表明，JAK2(janus kinase 2)和血小板生成素受体(thrombopoietin receptor，MPL)的突变与PMF发病密切相关[4-6]。造血干细胞中持续性激活的JAK/STAT3信号通路会引起巨核细胞(megakaryocyte)异常增殖，并分泌转化生子因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)和纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)，其中，TGF-β可以诱发骨髓成纤维细胞的恶性增殖，促进Ⅰ型、Ⅱ型等胶原蛋白的表达和分泌，引起骨髓纤维化及骨硬化[7,8]。但PMF疾病中，是否有其他细胞来源的TGF-β也参与骨髓纤维化进展尚不清楚。

巨噬细胞是一类固有免疫吞噬细胞，在炎症反应中浸润炎症部位，并通过分泌炎症细胞因子如TGF-β、IL-1β和IL-6调控炎症反应的发生，在肝脏、肺纤维化疾病中发挥重要作用[9]，然而其在PMF疾病进展中的功能还缺乏研究。本研究利用小鼠原代骨髓巨噬细胞和骨髓成纤维细胞，发现了巨噬细胞来源的TGF-β可以促进骨髓成纤维细胞的增殖及Ⅰ型胶原的表达。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂和材料 主要试剂：RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)购自ThermoFisher Scientific；抗TGF-β抗体(1D11)、重组人TGF-β蛋白、重组小鼠M-CSF蛋白购自R&D；TGF-β酶联免疫吸附实验试剂盒购自PeproTech；Ⅰ型胶原酶联免疫吸附实验试剂盒购自Abcam；脂多糖(LPS)、红细胞裂解液、二甲基亚砜(DMSO)、MTT购自Sigma。

1.1.2实验动物 8～12周龄的SPF级C57BL/6雄性小鼠购自北京维通利华公司，小鼠饲养于SPF屏障设施内。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓成纤维细胞和骨髓来源巨噬细胞的分离及培养 引颈处死小鼠，分离其胫骨和股骨，并剪去骨末端，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗骨髓，并用移液器反复吹打数次，使用40 μm孔径细胞滤器过滤，得到的骨髓细胞进行如下操作：将骨髓细胞直接接种于含有20% FBS的RPMI1640培养基中，置于37℃ CO2培养箱中培养48 h，换液去除未贴壁细胞，并继续使用含有10% FBS RPMI1640培养基培养至细胞汇合度达到85%～95%，得到骨髓成纤维细胞；或将骨髓细胞接种于含有10% FBS、20 ng/ml M-CSF的RPMI1640培养基中，培养6 d，得到骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs)。分离得到的BMMs经过胰蛋白酶消化、重悬，调整细胞密度为5×106个/ml。取50 μl细胞悬液，加入1 μl FITC-F4/80和PE-CD11b抗体，室温孵育40 min，随后用流式细胞仪检测F4/80+CD11b+细胞。

1.2.2酶联免疫吸附实验 取细胞培养基，1 000 g离心3 min，按照使用说明稀释样品和标准品，并将样品和标准品每孔加100 μl，每组设置3个复孔。随后洗去样品，加入检测抗体、显色底物、终止液，最后使用酶标仪读数，并利用标准曲线计算样品浓度。

1.2.3MTT法检测细胞增殖 将骨髓纤维细胞以5×103个/孔接种于96孔板，培养至指定时间后，每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续培养4 h，弃去培养基，加入100 μl DMSO溶解沉淀，使用酶标仪测定490 nm波长的吸光值(A)。

1.2.4BMM条件培养基的制备 在分离培养的BMMs 培养基中加入终浓度100 ng/ml的LPS，刺激细胞活化，培养24 h后收集培养基，1 000 g离心3 min，上清液即为BMM条件培养基(BMM conditioned medium,BMM-CM)。

2 结果

2.1ELISA检测LPS活化的BMMs中TGF-β的表达水平 BMMs经过6 d诱导分化及培养后，流式细胞仪检测其F4/80+CD11b+细胞比例为(92.8±2.1)%，细胞呈贴壁生长状态。在巨噬细胞中加入终浓度为100 ng/ml 的LPS刺激培养24 h后，培养基中TGF-β表达水平明显上调。对照组为(0.13±0.04)ng/ml，LPS组为(2.81±0.31)ng/ml，P=0.000 1 (图1)。

2.2ELISA检测TGF-β诱导的骨髓成纤维细胞Ⅰ型胶原的表达水平 骨髓成纤维细胞中加入终浓度为5 ng/ml的TGF-β培养24 h后，ELISA检测培养基中Ⅰ型胶原表达水平。其中对照组为(0.37±0.07)μmol/L，TGF-β组为(0.54±0.09)μmol/L，P=0.044 7，TGF-β组显著高于对照组(图2)。

2.3BMM-CM促进骨髓成纤维细胞增殖 骨髓成纤维细胞接种于96孔板中培养24 h后，加入终浓度5 ng/ml TGF-β或将培养基替换为BMM-CM，并在24 h、48 h和72 h时间点用MTT法检测细胞增殖活性。图3结果表明，TGF-β组及BMM-CM组细胞增殖活性明显高于对照组，并且TGF-β组也略高于BMM-CM组。

图1 LPS刺激BMMs表达TGF-βFig.1 LPS-induced TGF-β expression in BMMs

图2 TGF-β诱导的骨髓成纤维细胞Ⅰ型胶原的表达Fig.2 TGF-β-induced collagen Ⅰ expression in bone marrow fibroblasts

图3 TGF-β及BMM-CM促进骨髓成纤维细胞的增殖Fig.3 TGF-β and BMM-CM promote bone marrow fibroblasts proliferation

图4 TGF-β中和抗体对骨髓成纤维细胞活性及Ⅰ型胶原表达影响Fig.4 Effects of TGF-β neutralizing antibodies on bone marrow fibroblasts viabilities and collagen Ⅰ expression

2.4抗TGF-β抗体抑制骨髓成纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原表达 为了进一步确BMM-CM对骨髓成纤维细胞增殖活性的影响是由TGF-β引起的，本研究在BMM-CM中加入终浓度为0.5 μg/ml的抗TGF-β抗体，中和培养基中的TGF-β，对照组加入等浓度同型IgG，利用MTT法检测细胞增殖。结果表明，抗TGF-β组细胞增殖活性明显受到抑制(图4A)。此外，ELISA检测培养基中Ⅰ型胶原表达水平，对照组为(0.47±0.10 )μmol/L，而抗TGF-β组为(0.29±0.04)μmol/L，P=0.044 4。抗TGF-β组Ⅰ型胶原表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义。

3 讨论

骨髓成纤维细胞的异常增殖以及胶原蛋白的过度积累可以直接引发骨髓纤维化，然而对诱发骨髓成纤维细胞增殖及胶原蛋白表达的分子机制尚不明确。当前较为流行的观点认为骨髓纤维化是造血干细胞恶性增殖的继发反应，造血干细胞增殖引起的炎症细胞因子的表达可以引起骨髓纤维化病变[5]。其中，促炎因子TGF-β在这一过程中发挥了重要的作用。骨髓纤维化疾病进展过程复杂，早期研究已经发现骨髓纤维化病人单核-巨噬细胞活性提升[10]，但巨噬细胞能否通过分泌TGF-β促进骨髓纤维化病变还不是很清楚。本研究分离培养了原代BMMs，发现其可在LPS诱导激活后大量表达TGF-β，并且BMMs-CM能够有效促进骨髓成纤维细胞的增殖及Ⅰ型胶原的表达，其作用效果与直接添加TGF-β接近。进一步使用抗TGF-β抗体中和BMM-CM中的TGF-β，可以抑制骨髓成纤维细胞的增殖及I型胶原的表达，这些结果表明BMM-CM中的TGF-β是促进骨髓成纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原表达的主要因素。然而，BMM-CM中同时也存在热源物质(如LPS)和活化的巨噬细胞分泌的其他细胞因子(如IL-1β，IL-10等)，这些因素对骨髓成纤维细胞的增殖会产生怎样的影响还需在后续的研究中进行深入的探究。

当前越来越多的研究认为骨髓部位的炎症反应，尤其是慢性炎症很可能是引发骨髓纤维化病变的重要因素[11,12]，但在PMF疾病中，早期的炎症反应是如何起始的一直是本研究领域亟待解决的问题。炎症反应会引发造血细胞的应激进而产生更多的炎症因子，导致炎症反应的持续发展。TGF-β是引发病理性纤维化病变的最重要的炎症因子。骨髓微环境中的TGF-β与骨髓成纤维细胞表面的受体TBRⅠ和TBRⅡ结合，并引起下游Smad蛋白磷酸化激活，调控下游基因的转录。TGF-β一方面促进骨髓成纤维细胞增殖，一方面促进胶原蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖等基质的表达和分泌，引起细胞外基质性质改变[13]。本研究指出骨髓中的巨噬细胞也可能是PMF疾病进展过程中TGF-β的来源，而且靶向TGF-β的抗体能够抑制骨髓成纤维细胞的增殖及Ⅰ型胶原的表达，为靶向炎症反应的PMF临床治疗提供了研究基础。