羟丁酸钠通过Rho/Rho激酶信号通路减轻脑缺血再灌注大鼠脑损伤①

白芙蓉 吴 畏

(西南医科大学研究生院，泸州 646000)

脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CI/RI)是永久或短暂的脑血流减少或暂停后突然恢复血流，造成神经元、神经胶质细胞和脑血管功能障碍，导致中枢神经系统功能或代谢障碍[1]。据报道，CI/RI是全球第三大致死疾病，仅次于心脏病和癌症[2]。CI/RI的确切机制尚不明确，可能与细胞钙超载、兴奋性氨基酸的毒性、局部脑组织炎症反应和凋亡有关[3]。羟丁酸钠是中枢神经抑制性递质γ-羟基丁酸的中间代谢产物的钠盐，作为静脉麻醉药用于临床麻醉，可改善心肌缺血再灌注损伤，但具体机制尚不明确[4，5]。Rho在多种细胞过程(包括基因转录、细胞迁移、细胞凋亡、神经再生和细胞形态CI/RI中发挥关键作用，且能够通过Rho激酶调节细胞肌动蛋白重组及其下游效应子[6]。 Rho激酶是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由Rho激活并调节包括形态学、黏附、运动和增殖等多种细胞功能，被抑制时可减少脑组织炎症和细胞凋亡，保护抗体免受CI/RI损伤[7,8]。本研究通过Rho/Rho激酶信号通路探讨羟丁酸钠在大鼠CI/RI中的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 清洁级雄性SD 大鼠 160 只，体质量(220±10) g，购自四川夏派森医药科技有限公司，许可证号：SYXK(川)2017-203。

1.1.2试剂 羟丁酸钠(上海旭东海普药业有限公司，批号:国药准字H31020592)，尼莫地平(亚宝药业集团股份有限公司，批号：国药准字H14022821)，水仙环素(美国APExBIO公司，编号：A3642)，RIPA裂解缓冲液(南京海克尔生物科技有限公司，货号：SBJ-0999)，BCA试剂盒(上海易色医疗科技有限公司，货号：BC201)，Bax抗体(上海酶联生物科技有限公司，货号：ml120073 )，Bcl-2抗体(碧云天生物技术研究所，货号：AB112-1)，caspase-3抗体(碧云天生物技术研究所，货号：AC031-2)，RhoA抗体(美国Abcam公司，货号：ab54835)，Rho-kinaseα单克隆抗体(美国Abcam公司，货号：ab451710)和Rho-kinaseβ单克隆抗体(美国Abcam公司，货号：ab134181)，山羊抗兔二抗(上海康培科技有限公司，货号：C86-SSA004)。

1.2方法

1.2.1造模 根据参考文献[9]，通过右侧血管内大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)构建局灶性脑缺血再灌注模型：将大鼠麻醉，(37±0.5)℃，分离右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，将涂有聚赖氨酸的钝头4.0的单丝尼龙缝线通过右颈总动脉和颈外动脉插入颈内动脉，当远端遇到阻力时，固定尼龙线，阻断2 h后，取下丝线，使缺血区充分再灌注24 h。假手术组不用单丝尼龙缝线阻塞中动脉，其他处理同模型。

1.2.2分组及给药 根据参考文献[10,11]，将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、给药低剂量组、给药中剂量组、给药高剂量组、水仙环素组、给药高剂量+水仙环素组，每组20只。给药各组在造模前40 min腹腔给予50、100、200 mg/kg羟丁酸钠，1次/d，连续灌胃1 周。尼莫地平组每天给予0.7 mg/kg尼莫地平。水仙环素组和给药高剂量+水仙环素组还需每天给予10 mg/kg水仙环素。对照组和模型组大鼠注射等体积生理盐水。

1.2.3开场行为检测自发活动情况 根据参考文献[10]，造模后第8天进行开场行为测试。将大鼠放入72 cm×76 cm×57 cm木箱，底部均分为25个小格，记录10 min内大鼠爬行经过的格子数。

1.2.4T迷宫实验检测学习记忆能力 参考文献[10]，造模第8天，进行T迷宫测试。测试前一天将大鼠放在T迷宫(由1个主干和2个选择臂构成)内适应5 min，到达任一个臂均可获得食物。第2天，先将1个臂挡住，到达另1个臂可得到食物，将2个臂全部开放，但只有原来被挡住的臂内有食物，获得食物奖励记为正确，否则记作错误。进行20组实验记录选择正确次数。

1.2.5脑含水量检测 T迷宫实验后，麻醉后断头处死大鼠，分离脑组织，称重法测定脑含水量：脑干重/脑湿重。

1.2.6HE染色观察脑损伤 麻醉后处死大鼠，分离脑组织，4%多聚甲醛溶液固定，常规脱水制成石蜡切片，脱蜡、苏木精染色、1%盐酸酒精分化、0.6%氨水返蓝、 0.5%伊红染色，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，400倍显微镜观察脑组织损伤情况。

1.2.7TUNEL染色检测凋亡情况 将制好的石蜡切片按照TUNEL染色检测试剂盒说明书进行染色。每张切片在400 倍视野下随机选取5 个不交叉重复的视野，细胞核中出现棕黄色颗粒为凋亡细胞，计算脑细胞凋亡率。

1.2.8qRT-PCR检查RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ mRNA表达水平 采用RNA提取试剂盒从脑组织海马区中提取总RNA，使用cDNA逆转录试剂盒逆转录为cDNA。PCR反应条件：95℃预变性15 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延长20 s，40个循环。以β-actin为内参。应用凝胶成像系统(Bio-rad)摄影，Quan-tity One 软件扫描分析，计算采用2-ΔΔCt法。RhoA上游引物序列：5′-AGCCTGTGGAAAGACATGCTT-3′，下游引物序列：5′-TCAAACACTGTGGGCACATAC-3′；Rho-kinaseα上游引物序列：5′-TGCCAAGACCAAGGA-3′，下游引物序列：5′-GAGGCGTCAGCAGACAGAT-3′；Rho-kinaseβ上游引物序列：5′-TGCCTCATCGTCTTCA-3′，下游引物序列：5′-GCCCTTAATGTCCACGATTTC-3′。

1.2.9Western blot检测cleaved caspase-3、 Bax、Bcl-2、RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ 蛋白表达水平 提取脑组织海马区中总蛋白，采用BCA蛋白检测试剂盒进行定量。将25 μg蛋白质样品用12% SDS凝胶电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白封闭过夜，用兔抗大鼠cleaved caspase-3(1∶1 000)、 Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、RhoA (1∶1 000)、Rho-kinaseα单克隆抗体(1∶2 000)和Rho-kinaseβ单克隆抗体(1∶1 000)4℃孵育2 h，然后与山羊抗兔二抗(1∶1 000)在4℃的摇床上摇1 h，ECL曝光，Quantity One软件分析目标蛋白质的相对表达水平。

2 结果

2.1羟丁酸钠改善CI/RI大鼠自发活动和学习能力 与假手术组相比，模型组大鼠 10 min 内爬行经过的格子数目明显增多(P<0.01)，选择正确次数明显减少(P<0.01)；与模型组相比，给药低剂量组大鼠 10 min 内爬行经过的格子数目、选择正确次数差异无统计学意义(P>0.05)，给药中剂量组大鼠10 min 内爬行经过的格子数目减少(P<0.05)，选择正确次数增加(P<0.05)，尼莫地平组和给药高剂量组大鼠10 min内爬行经过的格子数目明显减少(P<0.01)，选择正确次数明显增加(P<0.01)，说明高剂量羟丁酸钠同尼莫地平一样，能够改善CI/RI大鼠自发活动,见图1A、B。

2.2羟丁酸钠改善CI/RI大鼠脑水肿 与假手术组相比，模型组大鼠脑组织含水量明显增多(P<0.01)；与模型组相比，给药低剂量组大鼠脑组织含水量差异无统计学意义(P>0.05)，给药中剂量组大鼠脑组织含水量减少(P<0.05)，尼莫地平组和给药高剂量组大鼠脑组织含水量明显减少(P<0.01)，说明羟丁酸钠高剂量同尼莫地平一样，能够改善CI/RI大鼠脑水肿，见图2。

2.3羟丁酸钠改善CI/RI大鼠脑损伤 假手术组大鼠脑组织显微结构正常，神经细胞形态结构正常，排列整齐，细胞质饱满，细胞核清晰；模型组神经细胞体积变小，细胞核出现皱缩，存在严重的炎症因子浸润；与模型组相比，给药各组和尼莫地平组大鼠神经细胞体积变小、细胞核皱缩和炎症因子浸润情况均有不同程度改善，见图3。

2.4羟丁酸钠改善CI/RI大鼠脑细胞凋亡 与假手术组相比，模型组大鼠脑组织细胞凋亡率明显提高(P<0.01), cleaved caspase-3 和Bax 表达明显上调、Bcl-2 表达明显下调(P<0.01);与模型组相比，给药低剂量组大鼠脑组织细胞凋亡率、cleaved caspase-3、Bax 和Bcl-2 表达差异无统计学意义(P>0.05),给药中剂量组大鼠脑组织细胞凋亡率、cleaved caspase-3、 Bax 和Bcl-2表达水平降低(P<0.05),尼莫地平组和给药高剂量组大鼠脑组织细胞凋亡率明显降低(P<0.01), cleaved caspase-3 和Bax 表达明显下调、Bcl-2表达明显上调(P<0.01),说明高剂量羟丁酸钠同尼莫地平一样,能够改善CI/RI大鼠脑细胞凋亡，见图4。

图1 各组大鼠自发活动和学习记忆能力 Fig.1 Spontaneous activity and learning and memory ability of rats in each group

图3 HE染色观察脑损伤情况(×400)Fig.3 Brain damage observed by HE staining(×400)

图4 各组大鼠脑细胞凋亡情况Fig.4 Brain cell apoptosis of rats in each group

2.5羟丁酸钠抑制CI/RI大鼠Rho/Rho 激酶信号通路 与假手术组相比,模型组大鼠脑组织中RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ mRNA 表达、蛋白表达明显上调(P<0.01);与模型组相比,尼莫地平组和给药低剂量组大鼠脑组织中RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ mRNA 表达、蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),给药中剂量组大鼠脑组织中RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ mRNA 表达、蛋白表达下调(P<0.05),给药高剂量组大鼠脑组织中RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ mRNA 表达、蛋白表达明显下调(P<0.01),说明高剂量羟丁酸钠可抑制CI/RI大鼠Rho/Rho 激酶信号通路，见图5。

图5 各组大鼠RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ 表达Fig.5 RhoA,Rho-kinaseα and Rho-kinaseβ expressions of rats in each group

图6 羟丁酸钠对CI/RI大鼠脑损伤的影响

2.6羟丁酸钠通过Rho/Rho激酶信号通路减轻CI/RI大鼠脑损伤 与模型组相比，给药高剂量组大鼠10 min内爬行经过的格子数目、脑含水量及脑组织凋亡率明显降低(P<0.01)，选择正确次数明显增多(P<0.01)，脑损伤明显减轻，水仙环素组大鼠10 min内爬行经过的格子数目、脑含水量及脑组织凋亡率明显提高(P<0.01)，选择正确的次数明显减少(P<0.01)，脑损伤明显加重；与给药高剂量组相比，给药高剂量+水仙环素组大鼠10 min内爬行经过的格子数目、脑含水量及脑组织凋亡率明显提高(P<0.01)，选择正确次数明显减少(P<0.01)，脑损伤明显加重，说明羟丁酸钠通过Rho/Rho激酶信号通路减轻CI/RI大鼠脑损伤，见图6。

3 讨论

脑缺血是神经内科常见疾病，主要治疗方式为溶栓，但血液再灌注会大脑继发性损伤，CI/RI损伤是导致成年患者死亡和残疾的最常见病理，疗效不理想[12-14]。因此，急需阐明药物对CI/RI的作用及机制。

羟丁酸钠是常用麻醉药物，起效慢、毒性小、无镇痛和肌松作用，用于诱导麻醉和维持麻醉，是中枢神经抑制性递质γ-羟基丁酸的中间代谢产物，通过γ-羟基丁酸调节通道使神经细胞膜超级化、降低神经元兴奋性、减少CI/RI损伤[15，16]。研究表明，羟丁酸钠不仅具有较强的氧自由基清除及抗脂质过氧化作用，还可抑制神经细胞凋亡，保护脑组织[17]。本研究发现，羟丁酸钠能够改善CI/RI损伤大鼠自发活动情况、记忆能力、脑水肿、脑损伤、脑细胞凋亡，并抑制Rho/Rho激酶信号通路。

Rho/Rho激酶信号通路是体内普遍存在的信号转导通路，通过调节细胞肌动蛋白骨架的聚合状态，参与调控细胞增殖与凋亡、细胞形态维持、基因转录、细胞黏附与迁移、平滑肌收缩等生物学行为，参与多种疾病发生发展，还可通路通过调节神经细胞迁移、增殖、轴突引导和再生，参与阿尔茨海默病、中风、癫痫等神经系统疾病的发生，在缺血，缺氧和炎症条件下，Rho/Rho激酶信号通路被异常激活[18-20]。本研究发现，Rho/Rho激酶信号通路激活剂水仙环素能够降低CI/RI损伤大鼠自发活动情况、记忆能力，增加脑水肿、脑损伤、脑细胞凋亡。抑制Rho/Rho激酶信号通路能够减轻缺血再灌注损伤[6]。本研究发现，添加Rho/Rho激酶信号通路激活剂水仙环素能够逆转羟丁酸钠对CI/RI损伤大鼠自发活动情况、记忆能力、脑水肿、脑损伤、脑细胞凋亡的改善，说明羟丁酸钠通过Rho/Rho激酶信号通路改善CI/RI大鼠自发活动情况、记忆能力、脑水肿、脑损伤、脑细胞凋亡。综上所述，羟丁酸钠通过抑制Rho/Rho激酶信号通路减轻大鼠脑损伤，为CI/RI治疗提供参考。