穿心莲内酯对克雷伯杆菌肺炎大鼠肺脏病理损伤、免疫功能紊乱及TLR4/NF-κB信号通路的调节作用①

亢瑞娜 何国莉 黄靓妹 刘晓霞 李君蕊

(唐山市工人医院感染性疾病科，唐山 063000)

肺炎是终末气道、肺泡和肺间质炎症统称，致病因素包括细菌、病毒、真菌、寄生虫等微生物及放射线、异物吸入等。克雷伯杆菌是细菌性肺炎常见致病菌，高发于婴幼儿，危及婴幼儿生命安全。肺炎患者体内存在大量炎症细胞因子和纤维，形成肺部机械损伤和宿主炎症介质、细胞因子激活释放的恶性循环。因此，肺炎治疗第一要务为抗炎。穿心莲内酯是从植物穿心莲叶片中提取得到的二萜内酯，具有抗炎抗菌、保肝、抗肿瘤、抗氧化和增强免疫等作用，广泛应用于各种炎症性疾病，如关节炎、神经炎、椎间盘退变等[1-9]。活化B细胞的核因子kappa轻链增强子(NF-κB)信号通路是炎症反应的关键介质，诱导各种促炎基因表达，包括编码细胞因子和趋化因子的基因[10]。研究表明穿心莲内酯抗炎活性与靶向TLR4/NF-κB信号通路有关，可能成为炎症的防治药物[6,9,11-13]。本研究采用气管滴入克雷伯杆菌的方法建立大鼠肺炎模型，研究穿心莲内酯对大鼠的抗炎作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体质量180～220g，购自北京维通利华公司，合格证号：SCXK (京) 2014-0001。饲养于无菌环境，26℃～28℃，50%～60%湿度，自由采食高压灭菌水和无菌饲料，适应性喂养1周后进行实验。

1.1.2试剂与仪器 穿心莲内酯粉末购自Sigma公司；TRIzol试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自美国ThermoFisher公司；HE染色试剂盒、Masson染色试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；一抗、二抗均购自英国Abcam公司；ECL化学发光液购自Invitrogen公司；ELISA试剂盒购自美国RB公司； BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所；肺炎克雷伯杆菌(1.5×109cfu/ml)购自重庆医科大微生物学教研室。PCR仪、电泳仪及半干转膜仪购自美国伯乐公司；Gel View 6000凝胶成像系统购自广州云星仪器有限公司；多功能酶标仪购自瑞士TECAN公司；普通光学显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1分组及给药 大鼠随机分为对照组(Control组)、模型组(Klebsiella组)、Kleb+Adnro(2.5 mg)组、Kleb+Adnro(5 mg)组和Kleb+Adnro(10 mg)组，每组12只。穿心莲内酯配制成10 mg/ml储存液，给药时稀释成0.25、0.5和1 mg/ml分别作为低、中、高剂量组。给药组自造模前1 d腹腔注射10 ml/kg 穿心莲内酯，对照组和模型组腹腔注射等体积灭菌生理盐水，连续7 d。给药结束后，眼眶采血后脱颈椎处死大鼠，取血清和肺脏进行后续实验。

1.2.2建模 参考文献[7]，10 %水合氯醛麻醉大鼠，无菌切开颈部皮肤，暴露上段气管，经气管滴入0.15 ml菌液后竖直固定1 min，对照组滴入等体积生理盐水。

1.2.3W/D值测定 取大鼠右肺中叶用预冷的PBS充分洗涤，吸水纸去除水分，称量湿重(W)。80℃干燥48 h，称量干重(D)，计算W/D。

1.2.4HE染色和Masson染色 将左肺用预冷的PBS充分洗涤，10 %中性福尔马林固定，脱水、透明、浸蜡和包埋，制成5 μm切片。行HE和Masson染色，光学显微镜下观察肺脏病理学改变和纤维化情况。

1.2.5Western blot检测Caspase-3、Caspase-9、NF-κB p65和IκBα表达 RIPA蛋白裂解液于冰上提取各组肺组织总蛋白，BCA试剂盒检测各组蛋白浓度并调平。每组取等量蛋白质用12%SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗，4℃孵育过夜。弃去一抗，缓冲液清洗PVDF膜，加入对应二抗，室温封闭1 h，滴加ECL于暗室曝光显影。以GAPDH或LAMIN A为内参。

1.2.6ELISA检测大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量 眼眶静脉丛取血，4℃下3 000 r/min离心10 min，收集上清保存于-80℃备用。严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.7RT-PCR检测NF-κB p65和IκB表达 Trizol试剂提取各组大鼠肺脏组织总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA，PCR扩增，荧光定量PCR试剂盒检测cDNA。

2 结果

2.1穿心莲内酯减轻肺炎大鼠肺脏损伤 与对照组相比，模型组大鼠右肺W/D值明显增加(P<0.05)，而穿心莲内酯治疗组大鼠右肺湿重/干重比值与模型组相比明显降低(P<0.05)，见图1A。

对照组大鼠肺组织结构基本完整，未见炎症细胞浸润或间质增厚；模型组出现包括肺泡塌陷、肺泡壁厚度增加、间质水肿、充血，炎症细胞浸润和成纤维细胞间质浸润等组织病理学改变；给药剂量增加，穿心莲内脂治疗组大鼠肺组织病理学改变及纤维化程度随之改善，提示建模成功，见图1B。

对照组大鼠肺泡结构正常，未见明显病理变化；与对照组相比，模型组大鼠肺泡结构破坏严重，肺泡腔基本消失，蓝色胶原纤维呈弥漫性增生沉积；给药组大鼠仍有肺泡结构，胶原纤维沉积较模型组明显减轻，且与给药剂量呈负相关，提示建模成功，见图1C。

图1 穿心莲内酯对肺炎大鼠肺脏损伤的影响(×200)Fig.1 Effects of Andro on lung injury in pneumonia rats(×200)

图2 穿心莲内酯对肺炎大鼠凋亡相关蛋白表达的影响Fig.2 Effect of Andro on expressions of apoptosis-related proteins in pneumonia rats

2.2穿心莲内酯减少大鼠凋亡相关蛋白表达水平 与对照组相比，模型组大鼠高表达裂解形式的Caspase-3和Caspase-9(P<0.05)，穿心莲内脂治疗组蛋白表达水平较模型组明显下调(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见图2。

2.3穿心莲内酯降低肺炎模型大鼠炎症反应 与对照组相比，模型组大鼠炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6血清表达水平均明显上调(P<0.05)；与模型组相比，穿心莲内酯治疗组炎症因子水平随给药剂量增加而下降(P<0.05)，见图3。

图3 穿心莲内酯对肺炎大鼠血清炎症细胞因子含量的影响Fig.3 Effect of Andro on concentration of inflammatory cytokines in serum of pneumonia rats

图4 穿心莲内酯对肺炎大鼠IκBα和NF-κB p65磷酸化水平的影响Fig.4 Effects of Andro on phosphorylation of IκBα and NF-κB p65 in pneumonia rats

2.4穿心莲内酯抑制肺炎大鼠IκBα和NF-κB p65磷酸化激活 与对照组相比，模型组大鼠p-IκBα和p-NF-κB p65 mRNA表达水平明显上调(P<0.05)；经穿心莲内酯治疗后，mRNA表达水平明显下调(P<0.05)，且与给药剂量呈负相关。Western blot检测结果与RT-PCR类似，证明穿心莲内酯能下调IκBα和NF-κB p65磷酸化水平，从而抑制该通路的激活，见图4。

3 讨论

克雷伯杆菌是最早被发现的能引起肺炎的革兰氏阴性杆菌，克雷伯杆菌肺炎因其并发症高耐药性而威胁公共卫生安全[14]。段争等[15]研究认为PM2.5暴露。降低肺脏对细菌的清除能力，加重炎症反应，增加大鼠肺脏对细菌、病毒等的敏感性，使条件致病菌成为致病菌。当致病菌到达下呼吸道时，肺泡毛细血管发生渗透性水肿、充血、炎症细胞浸润及纤维沉积等，因此，课题组采用气管滴入克雷伯杆菌的方法构建肺炎模型，测量大鼠肺脏W/D比值，HE和Masson染色结果证明肺炎模型建立成功。本文研究也证实穿心莲内酯能有效缓解肺脏病理损伤和纤维化，与具有强大抗炎活性的碧萝芷(松树皮萃取物)通过抑制NF-κB介导的炎症反应改善肺损伤相似[16]。

炎症性疾病的病理特征是细胞过度凋亡和促炎因子产生，许多天然化合物在抗细胞凋亡和/或炎症干预上表现出生物学活性，如碧萝芷、丹参酚酸B、牛蒡子苷元等，穿心莲内酯在干预炎症和凋亡性疾病中作用明显。在体内体外实验中均表现出抗凋亡作用[9，16-18]。体外培养小鼠T细胞，穿心莲内酯在不影响细胞活性的情况下通过抑制细胞凋亡和炎症细胞因子释放发挥有效的免疫抑制作用，在脓毒症小鼠模型中，能通过减少心肌细胞凋亡等机制减轻脂多糖诱导的心脏功能紊乱[19，20]。本研究表明穿心莲内酯能降低肺炎大鼠凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9表达，下调炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的血清表达水平，这可能与大鼠肺部细菌清除增加有关，有效改善大鼠肺部病理学。

NF-κB是调节炎症最重要的转录调节因子，激活的NF-κB可转移到细胞核并与促炎基因启动子结合，导致基因表达增强和炎症反应扩增，从而导致炎症损伤。因此，阻断NF-κB转录活性可能是治疗炎症的重要靶点[21-23]。脂多糖诱导的髓核变性研究发现，穿心莲内酯治疗后，细胞凋亡率、炎症介质表达均明显降低，其机制与抑制NF-κB途径密切相关[9]。穿心莲内酯能显著抑制促炎细胞因子IL-1β对髓核细胞凋亡的诱导作用，明显抑制Toll样受体(TLRs)、髓系分化因子88(MYD88)激活和NF-κB核易位[12]。本研究观察到克雷伯杆菌肺炎大鼠肺组织NF-κB p65和其抑制蛋白IκBα的mRNA和蛋白水平显著升高，穿心莲内酯可抑制两者表达。

综上所述，穿心莲内酯能降低克雷伯杆菌肺炎大鼠肺脏W/D比值，缓解肺组织充血、水肿、炎症细胞浸润和胶原沉积，改善肺组织形态和纤维化情况，抑制血清TNF-α、IL-1β和IL-6表达，并抑制NF-κB p65和IκBα磷酸化水平。穿心莲内酯通过抑制TLR4/NF-κB信号通路活化，改善克雷伯杆菌肺炎大鼠的肺脏病理损伤和免疫功能紊乱，为穿心莲内酯治疗细菌性肺炎提供参考。