沉默FGL1对肺腺癌细胞吉非替尼药物敏感性的影响

高薇薇, 孙翠兰, 郝吉庆

肺癌发病率逐年上升，已成为全世界癌症相关死亡的主要原因之一[1]。非小细胞肺癌(non small lung cancer, NSCLC)是最常见的肺癌病理类型，约占总数的85%，而其中肺腺癌为最主要的病理类型。近年来，随着对分子靶向药物的深入研究，酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)类分子靶向药物在治疗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)敏感突变的晚期肺腺癌方面取得了重大进展，其中吉非替尼在临床上显著提高了肺腺癌患者的生存率。但在EGFR-TKIs治疗平均9.2～14.7个月后继发性耐药会不可避免地发生[2]。因此，如何提高EGFR-TKIs耐药患者的药物敏感性是目前临床亟待解决的难题。此外，研究[3-4]表明程序性死亡蛋白配体1(programmed death protein-ligand 1，PD-L1)高表达也与EGFR-TKIs耐药性存在密切关系。纤维蛋白原样蛋白1(fibrinogen-like protein 1，FGL1)是最新发现的免疫逃逸分子，在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤和结直肠癌中表达升高，其中肺癌上调百分比最高(35%)[5]，但FGL1是否参与EGFR-TKIs耐药尚无研究。该研究观察沉默FGL1对人肺腺癌吉非替尼耐药细胞PC9/GR药物敏感性的影响及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞培养 人肺腺癌吉非替尼敏感细胞株PC9 和人肺腺癌吉非替尼耐药细胞株PC9/GR购自中国科学院上海细胞库，均培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.1.2主要试剂和仪器 高糖DMEM培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物公司；lipofectamineTM2000瞬时转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂盒购自美国Apexbio公司；Annexin V-FITC / PI细胞双染凋亡检测试剂盒购自上海优宁维生物技术公司；荧光定量PCR试剂盒及逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；Bcl-2、Bax、Caspase-3(一抗)购自美国Abcam公司；山羊抗兔多抗、山羊抗鼠多抗(二抗)购自北京中杉金桥公司；吉非替尼购自大连美仑生物科技有限公司，按照说明书配成浓度为10 mmol/L的溶液，分装后存放于-20 ℃冰箱中备用。细胞培养箱为美国SHELDON公司产品；酶标仪为美国Bio-Tek仪器公司产品；流式细胞仪为英国BD Bio-sciences公司产品。该实验中使用的基因和引物序列见表1，无关的通用序列用为阴性对照。

1.2 方法

1.2.1细胞转染 将3条不同序列的siRNA随机命名为FGL1-siRNA-1、2、3，实验分为4组：对照组(转染NC-siRNA)、siFGL1-1组(转染FGL1-siRNA-1)、siFGL1-2组(转染FGL1-siRNA-2)、siFGL1-3组(转染FGL1-siRNA-3)。取对数生长期的肺腺癌吉非替尼耐药细胞PC9/GR，稀释为3.0×105个/ml的细胞悬液，接种至6孔板中培养，待细胞融合至70%时，换成无双抗无血清的培养基，应用lipofectamineTM2000试剂盒进行瞬时转染，严格按照试剂盒说明书要求操作，放于37 ℃培养箱培养6 h，换成完全培养基继续培养48 h。采用Western blot法和RT-qPCR法确定转染效率。

表1 siRNA的序列及实时定量PCR目的基因的引物

1.2.2FGL1mRNA和蛋白的表达情况 应用RT-qPCR法测定PC9组、PC9/GR组及转染的PC9/GR-siNC、PC9/GR-siFGL1细胞中FGL1表达情况：TRIzol法提取总RNA，逆转录获得产物cDNA，采用Takara SYBR Green荧光定量试剂盒测定FGL1表达情况，以GAPDH为管家基因，由公式Folds=2-△△CT检测目的基因的相对表达强度。应用Western blot法检测各组FGL1蛋白表达情况：收集各组细胞，加入细胞裂解液RIPA/PMSF(100 ∶1)将细胞重悬，冰上裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min离心30 min，取上清液，BCA法测定总蛋白浓度，在SDS-PAGE凝胶中电泳，转膜、封闭，β-actin、FGL1、Bcl-2、Bax、Caspase-3(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜，HRP标记的山羊抗鼠与山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)，二抗室温孵育1 h，用ECL化学发光试剂盒进行显影，以β-actin为内参。

1.2.3CCK-8实验测定细胞增殖 收集PC9、PC9/GR细胞及转染的PC9/GR-siNC、PC9/GR-siFGL1细胞，各组细胞稀释为4×104个/ml细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μl，培养24 h后，把含不同浓度梯度的吉非替尼培养基加入对应各组孔中，(吉非替尼药物浓度梯度设定：0、0.08、0.04、0.2、1、5、10、20、40 μmol/L)，培养48 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育2 h后，酶标仪上测吸光度(optical density,OD)450值。细胞活力值(%)=[(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%，并计算各组的IC50值。每组浓度设5个复孔，独立重复实验3次。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡率 设置PC9/GR组、PC9/GR-siNC组、吉非替尼组、PC9/GR-siFGL1组及吉非替尼+PC9/GR-siFGL1组，取6孔板作PC9/GR细胞瞬时转染，24 h后，吉非替尼组和PC9/GR-siFGL1+吉非替尼组同时加入含有终浓度5 μmol/L吉非替尼的5%FBS的DMEM培养基，培养24 h后，参考试剂盒说明书收取细胞，2 000 r/min 离心5 min，弃上清液，用预冷的PBS(4 ℃)重悬1次，再次2 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入300 μl的1×Binding Buffer重悬细胞，再加入5 μl的Annexin V-FITC，充分混匀，室温下避光孵育15 min，上机前5 min再加入5 μl的PI及200 μl的1× Binding Buffer，充分混匀，上机检测凋亡率。独立重复实验3次。

1.2.5Western blot测定细胞中凋亡相关蛋白的表达 实验分组同1.2.4项。取6孔板作PC9/GR细胞瞬时转染，24 h后，吉非替尼组和PC9/GR-siFGL1+吉非替尼组同时加入含有终浓度5 μmol/L吉非替尼的5% FBS的DMEM培养基，24 h后，收集细胞，提取总蛋白，步骤同1.2.2项。

2 结果

2.1 FGL1在细胞株PC9和PC9/GR细胞中表达Western blot及实时荧光定量PCR检测结果显示：PC9/GR组细胞中FGL1表达水平高于PC9组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1A、B。另外，与PC9/GR-siNC组相比，PC9/GR-siFGL1-2组和PC9/GR-siFGL1-3组FGL1表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)，但PC9/GR-siFGL1-2组FGL1表达下调最显著，故选取PC9/GR-siFGL1-2组的FGL1-siRNA进行后续实验。见图1C、D。

2.2 CCK-8实验测定不同方式处理后耐药细胞PC9/GR增殖活性CCK-8实验结果显示：吉非替尼对PC9组、PC9/GR组及PC9/GR-siFGL1组细胞增殖的抑制作用均随着浓度的增加而逐渐增强。PC9/GR组细胞的吉非替尼IC50高于PC9组细胞的吉非替尼IC50，差异有统计学意义(P<0.001)。此外，与PC9/GR组和PC9/GR-siNC组相比，PC9/GR-siFGL1组细胞的吉非替尼IC50明显降低，差异有统计学意义(P<0.001)，PC9/GR-siNC组与PC/GR组细胞IC50比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图1 Western blot实验和实时荧光定量PCR检测FGL1的表达量

A: PC9组与PC9/GR组细胞中FGL1蛋白的表达；B：PC9组与PC9/GR组细胞中FGL1 mRNA的表达；C：转染后4组细胞FGL1蛋白的表达；D：转染后4组细胞FGL1 mRNA的表达；1：siNC；2：siFGL1-1； 3：siFGL1-2；4：siFGL1-3；与PC9组比较：**P<0.01；与siNC组比较:##P<0.01

2.3 流式细胞术检测沉默FGL1对PC9/GR细胞凋亡的影响流式细胞术检测各组细胞总凋亡率，PC9/GR组[(5.69±0.89)%]、PC9/GR-siNC组[(6.04±0.85)%]、吉非替尼组[(11.56±1.75)%]、PC9/GR-siFGL1组[(25.58±1.86)%]、吉非替尼+PC9/GR-siFGL1组[(35.02±2.58)%]，5组细胞总凋亡率之间差异有统计学意义(F=103.711，P<0.000 1)。与PC9/GR组比较，吉非替尼组细胞总凋亡率有所升高，差异有统计学意义(P<0.01)。而沉默FGL1后，PC9/GR细胞凋亡率明显升高，联合吉非替尼后，细胞总凋亡率最高，差异均有统计学意义(P<0.001)。PC9/GR-siNC组与PC9/GR组比较，细胞总凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

2.4 Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白的表达情况Western blot法结果显示，无活性的Caspase-3在各组细胞中表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与PC9/GR组相比，单独应用吉非替尼后，Bax蛋白表达有所上调、Bcl-2蛋白表达有所下调，但差异无统计学意义(P>0.05)，而Cleaved-Caspase-3表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)。而沉默FGL1后，Bcl-2蛋白表达下调，Bax蛋白表达上调，且联合吉非替尼后，Bcl-2下调、Bax上调更加明显，差异有统计学意义(P<0.05)。此外，沉默FGL1后，活化的Cleaved-Caspase-3表达水平明显上调，差异有统计学意义(P<0.05)。PC9/GR-siNC组与PC9/GR组比较，各蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)(图4)。

图2 CCK-8实验测定吉非替尼对PC9、PC9/GR、PC9/GR-siNC和PC9/GR-siFGL1细胞的增殖抑制效应

A：CCK-8实验检测4组细胞的细胞活力；B：4组细胞的IC50值；1：PC9组；2：PC9/GR组；3：PC9/GR-siNC组；4：PC9/GR-siFGL1组；与PC9组比较：***P<0.001；与PC9/GR-siNC组比较：###P<0.001；与PC9/GR组比较：△△△P<0.001

图3 流式细胞术检测各组细胞的凋亡率
A: PC9/GR组; B: PC9/GR-siNC组; C: 吉非替尼组; D: PC9/GR-siFGL1组; E: 吉非替尼+PC9/GR-siFGL1组

图4 Western blot检测各组凋亡相关蛋白的表达水平

A: PC9/GR组; B: PC9/GR-siNC组; C: 吉非替尼组; D: PC9/GR-siFGL1组; E: 吉非替尼+PC9/GR-siFGL1组；与PC9/GR组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与吉非替尼组比较：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与PC9/GR-siFGL1组比较：△P<0.05

3 讨论

在欧美国家中，约10%～15%的肺腺癌患者携带EGFR酪氨酸激酶域内的激活突变，而在亚洲国家中，EGFR突变病例高达40%～50%[6-7]。目前，EGFR-TKIs类靶向药物已作为晚期EGFR敏感突变的肺腺癌患者的一线标准治疗方案，然而，EGFR-TKIs继发性耐药的发生大大缩短了患者的生存期。研究[8]显示继发性耐药机制有多种，包括T790M突变、MET基因激活、ERBB2基因扩增、小细胞肺癌的上皮间质转化等，也与PD-L1高表达相关。而FGL1与PD-L1相同，与T细胞表面的相应受体相结合，从而逃逸机体免疫监视，但对FGL1是否参与吉非替尼继发性耐药研究较少。

FGL1在多种肿瘤中表达上调，Zhang et al[9]研究表明在胃腺癌中，FGL1高表达的患者预后差，且沉默FGL1可抑制胃腺癌细胞的侵袭和迁移。本研究显示，与吉非替尼敏感细胞PC9相比，FGL1在吉非替尼耐药细胞PC9/GR中表达明显上调。采用小干扰RNA(siRNA)技术沉默PC9/GR细胞FGL1基因，用于后续实验。CCK-8实验结果显示相比较于PC9/GR细胞和PC9/GR-siNC细胞，沉默FGL1基因后PC9/GR细胞的增殖能力明显下降，表明沉默FGL1能够抑制肺腺癌吉非替尼耐药细胞PC9/GR的增殖。不同浓度的吉非替尼处理后，PC9、PC9/GR、PC9/GR-siNC、PC9/GR-siFGL1各组细胞的吉非替尼IC50分别为(0.39±0.26)、(18.18±1.26)、(16.82±0.75)、(0.94±0.25)μmol/L，表明PC9/GR细胞确实对吉非替尼耐药，并且沉默FGL1的PC9/GR耐药细胞吉非替尼IC50明显低于对照组细胞，表明沉默FGL1一定程度上恢复了PC9/GR对吉非替尼敏感性。

Bcl-2是Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，在乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病等多种肿瘤细胞中，Bcl-2的表达下调可诱导细胞凋亡，甚至克服耐药性[10-11]。且Zou et al[12]研究发现，沉默Bcl-2可提高耐吉非替尼耐药的H1975肺癌细胞系对吉非替尼的敏感性。Bax基因是Bcl-2基因家族中一个促进凋亡的基因，参与细胞色素C的释放并诱导Caspase依赖的凋亡途径[13-14]。本研究中，流式细胞术实验证实PC9/GR-siFGL1组细胞凋亡率增加，而吉非替尼+PC9/GR-siFGL1组PC9/GR细胞凋亡率更高，差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果提示沉默FGL1或联合吉非替尼均能引起抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)。Caspase-3是细胞中一组半肽氨酸蛋白酶，同时参与内外源性凋亡途径。正常情况下，Caspase-3是无活性的，但在细胞接受凋亡刺激后，下游Caspases级联激活，进而诱导细胞发生凋亡[15]。本研究结果显示，Caspase-3在各组细胞中表达差异无统计学意义(P>0.05)，PC9/GR-siFGL1组及联合组Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表达增加，与流式细胞术检测细胞凋亡率的结果一致，进一步说明沉默FGL1及联合吉非替尼均能诱导肺腺癌耐药细胞凋亡，且联合处理更加促进细胞凋亡。以上结果可能是通过下述机制实现的：通过上调促凋亡蛋白表达、下调抗凋亡蛋白表达以促进耐药细胞凋亡，从而导致沉默FGL1增强了PC9/GR细胞吉非替尼药物敏感性，对于沉默FGL1是否还存在其他恢复药物敏感性的机制仍需深入研究。