白细胞介素-11对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响

纪兴虎，卞尔保，徐雅娣，程 梦，张正伟，孙立波，陈 杰，赵 兵

胶质瘤是最常见的成人中枢神经系统恶性肿瘤，手术是最常见的治疗方法，术后常辅助放疗和化疗[1]。但是由于肿瘤浸润生长的特点，手术不能完全切除，因此术后复发率和死亡率高[2]。

白细胞介素11(interleukin-11,IL-11)是系统发育相关细胞因子IL-6家族的一员。与该细胞因子家族的成员一样，IL-11可以与广泛表达的GP130亚基形成受体复合物，从而激活JAK信号转导子和STAT3通路[3]。IL-11是由多种细胞在炎症刺激下而产生，并参与刺激红细胞生成、神经发生和血小板的成熟。近年来的研究[3-5]表明IL-11在多种肿瘤的生物学进展中发挥巨大作用，其在肿瘤中的过表达促进肿瘤的增殖及迁移与侵袭能力。IL-11在肿瘤中的作用受到许多学者的关注，然而IL-11在胶质瘤中是否发挥作用仍然没有研究报道。该研究前期实验显示，与正常脑组织相比，IL-11在胶质瘤组织中表达升高。为了进一步探索IL-11在胶质瘤中的作用机制，该实验以SF126细胞作为实验对象，探究了IL-11对胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂IL-11敲减质粒(shIL-11)由上海吉凯基因合成；IL-11引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，重组人IL-11(rhIL-11)(美国Proteintech公司)，LipofectamineTM2000及TRIzol(美国Invitrogen公司),PrimeScriptTMRT Master Mix 逆转录试剂盒及 SYBR Green PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)，胎牛血清FBS(美国Gbico公司)，高糖培养基DMEM(美国Hyclone公司)，胰蛋白酶(上海碧云天科技公司)，基质胶(美国BD公司)，Transwell小室(美国Corning公司)。

1.2 仪器恒温培养箱(NAPCO-8800,美国SHELLAB公司)，倒置显微镜(TS100，日本Nikon公司)，超净工作台(SW-9800,苏州净化设备公司)，逆转录仪(FlexCycler，德国ANALYTIKJENA公司)，实时定量PCR仪(CFX ConnectTM,美国Bio-rad公司)。

1.3 细胞系及培养方法人胶质瘤细胞SF126和正常人脑星形胶质细胞HEB购自上海中国科学院。细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM中(培养条件：37 ℃、5%CO2恒温培养箱)。在倒置显微镜下观察，当细胞汇合率达到80%以上时进行细胞传代。

1.4 方法

1.4.1qRT-PCR实验检测细胞mRNA表达 用TRIzol法提取细胞总RNA，并按10 μl反应体系进行逆转录：PrimeScriptTMRT Master Mix 2 μl，总RNA量600 ng，加无酶水至10 μl，根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。最后以cDNA为模板使用对应引物进行目的基因的扩增,反应体系为10 μl: cDNA 1.6 μl，特异性引物3.2 μl，SYBR 5.2 μl。以GAPDH作为内参。引物序列如下：IL-11，5′-GCTGCAAGGTCAAGATGGTT-3'(正向引物) 和5′-GCTGGGTGGCGTTCTATC-3'(反向引物)；GAPDH, 5′-AGCAAGAGCACAAGAGGAAG-3′(正向引物) 和5′-GGTTGAGCACAGGGTACTTT -3′(反向引物)。qRT-PCR反应条件为:预变性95 ℃、10 min，变性95 ℃、15 s，退火60 ℃、60 s,循环40次。使用2-ΔΔCt法计算对应mRNA的表达。

1.4.2shIL-11质粒转染SF126细胞 将处于对数期生长的细胞接种于6孔板中(1×106个/ml),于第2天细胞贴壁后按 Lip2000试剂说明书转染shIL-11，于4 h后换液，PBS清洗6孔板2次，用含10%FBA的DMEM的培养基继续培养48 h后收集细胞进行后续实验。将shIL-11质粒转染后的SF126细胞设为shIL-11组，并将转染空载质粒的细胞作为对照组即NC组。

1.4.3克隆形成实验检测细胞增殖能力 取预处理的细胞胰酶消化，按1×103个/孔接种于6孔板中，37 ℃、5%CO2恒温培养箱中继续培养7 d(培养期间需更换培养基)。结束培养后，倒掉培养基用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定细胞20 min,再次用PBS清洗，之后用0.1%结晶紫染色30 min,计算克隆细胞数。使用ImageJ软件计算克隆形成细胞数目，每组设置3个重复孔。

1.4.4Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力 将预处理的细胞用胰酶消化，并用无血清培养基制备成细胞悬液。将100 μl含5×104个细胞的悬液加到小室上层，在小室下层加入含30% FBS的培养基600 μl。于37℃、5%CO2恒温培养箱中继续培养24 h后，将小室取出，用棉签擦去小室上层细胞，PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛固定细胞30 min,再次用PBS清洗小室，用0.1%结晶紫染色15 min,清洗并晾干后于显微镜下观察，统计穿膜细胞数目。细胞侵袭能力的检测需要预先在小室上层加入1 ∶5稀释后的基质胶(预先4 ℃过夜融化)，并置于37 ℃培养箱干燥30 min,待胶凝固后加入1×105个细胞于小室内,培养48 h，之后的步骤与迁移实验相同。使用ImageJ软件计算穿膜细胞数目，每组设置3个重复小室。

2 结果

2.1 IL-11在胶质瘤中的表达收集临床胶质瘤样本与正常脑组织样本，通过qRT-PCR分析IL-11的表达。结果显示IL-11在胶质瘤样本中的表达高于正常脑组织，差异有统计学意义(t=4.77，P<0.01)，见图1A。在本研究中选取正常人脑星形胶质细胞HEB与人胶质瘤细胞SF126，并检测了两种细胞系中IL-11的mRNA表达水平，结果显示SF126细胞的IL-11 mRNA相对表达水平高于HEB细胞，差异有统计学意义(t=13.43，P<0.001)，见图1B。

图1 IL-11在胶质瘤中的表达

A：胶质瘤组织与正常脑组织中IL-11的相对表达量；B：IL-11在HEB与SF126 2种细胞系中mRNA的表达量；1：正常脑组织；2：胶质瘤组织；a：HEB细胞；b：SF126细胞；与正常脑组织比较：**P<0.01；与HEB细胞比较：###P<0.001

2.2 qRT-PCR法检测shIL-11转染胶质瘤细胞SF126后IL-11的表达qRT-PCR技术检测细胞IL-11的mRNA表达情况。如图2所示，与NC组相比，shIL-11组中IL-11的表达下调，差异有统计学意义(t=6.46，P<0.05)。表明shIL-11转染SF126细胞可成功下调细胞中IL-11 表达水平。

2.3 IL-11促进SF126细胞的增殖克隆形成实验检测细胞的增殖能力。shIL-11转染SF126细胞后将细胞培养于6孔板内，于第7天进行检测。结果显示：shIL-11组的克隆细胞数少于NC组，差异有统计学意义(t=4.40，P<0.05)，见图3A、C。此外，用rhIL-11(60 ng/ml)处理SF126细胞并于6孔板内培养7 d。克隆形成实验结果表明:IL-11组克隆细胞数相对空白对照组增多，差异有统计学意义(t=8.38，P<0.01),见图3B、D。上述结果提示，IL-11促进胶质瘤细胞的增殖能力。

图2 shIL-11转染SF126细胞后IL-11的相对表达量

2.4 IL-11促进SF126细胞的迁移和侵袭能力Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。结果显示，与NC组相比，shIL-11组细胞迁移能力受到抑制，差异有统计学意义(t=5.96，P<0.01)，见图4A、C。与此相似，敲减处理后的SF126细胞侵袭能力同样被抑制，差异有统计学意义(t=10.51，P<0.001)，见图4B、C。之后的研究中用浓度为60 ng/ml 的IL-11处理SF126细胞。Transwell结果显示，与空白对照组相比较，IL-11组细胞的迁移数增加,差异有统计学意义(t=8.38，P<0.01),见图5A、C。相似的，与空白对照组比，IL-11处理后的细胞侵袭细胞数增加，差异有统计学意义(t=7.83，P<0.01)，见图5B、C。

3 讨论

胶质瘤是成人最常见且具高度侵袭性的原发肿瘤[6]。尽管近些年胶质瘤在治疗方面取得了不错的进展，但是由于肿瘤本身生长迅速且呈浸润性生长的特点，患者预后不理想且常规治疗的中位生存期不足15个月[7]。肿瘤的高度浸润性是恶性胶质瘤最突出的生物学特征，也是引起肿瘤频繁复发和预后不佳的主要原因[8]。因此，探讨胶质瘤增殖和侵袭的分子机制已成为胶质瘤诊断和治疗的热点。

IL-11是IL-6细胞因子家族的一员，与该家族细胞成员共享受体亚基gp130[9]。IL-11是在骨髓基质细胞培养基中首次发现，之后的研究[4]表明在成骨细胞、滑膜细胞、成纤维细胞、软骨细胞、滋养细胞、肝细胞、胃肠道上皮细胞等细胞中也有表达，但IL-11分泌的主要来源仍不清楚。IL-11是一种多效性细胞因子，传统上认为IL-11可以起到抗感染、抗凋亡的作用，也有促炎细胞因子的作用，提示其在免疫应答中的复杂功能[4,10]。但是在近几年的研究[4]中发现，IL-11参与多种肿瘤的恶性进展，包括胃癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和子宫内膜癌等。IL-11在胃癌患者肿瘤组织中的表达水平升高是一种常见的现象，并与肿瘤的进展相关[11]。Yang et al[12]研究发现，IL-11在食管鳞癌中高表达且促进肿瘤的增殖和侵袭，而敲减IL-11可以抑制肿瘤的进展。在乳腺癌中IL-11的高表达将会促进乳腺癌的增殖与侵袭[13]。此外，Liang et al[14]研究证明抑制IL-11-STAT3信号轴将会减少乳腺癌的生长和转移。然而IL-11是否参与胶质瘤增殖与侵袭过程仍未有研究报道。

图3 IL-11对SF126细胞增殖的影响

A、C：克隆形成实验检测shIL-11转染SF126细胞对增殖的影响；B、D：克隆形成实验检测60 ng/ml IL-11处理SF126细胞后对增殖的影响；1：NC组；2：shIL-11组；a：空白对照组；b：IL-11组；与NC组比较：*P<0.05；与空白对照组比较：##P<0.01

图4 shIL-11转染SF126细胞对迁移和侵袭的影响 结晶紫染色×100

A：shIL-11转染SF126细胞对迁移的影响；B：shIL-11转染SF126细胞对侵袭的影响；C：迁移与侵袭实验数据统计图；1：NC组；2：shIL-11组；与NC组比较：**P<0.01，***P<0.001

在本研究中，qRT-PCR检测胶质瘤样本与正常脑组织样本中IL-11的表达，结果显示胶质瘤中IL-11的表达高于正常脑组织。同样在胶质瘤细胞系中IL-11也呈现出高表达。为了探究IL-11在胶质瘤增殖、迁移与侵袭过程中所发挥的作用，本实验构建了shIL-11质粒用于敲低胶质瘤细胞中IL-11的表达。qRT-PCR结果显示，与NC组比，shIL-11组中mRNA表达下调。 后续研究证明敲低IL-11可抑制SF126细胞的增殖、迁移与侵袭能力。此外，用rhIL-11处理SF126细胞，实验结果表明IL-11处理细胞后促进了胶质瘤细胞的增殖与侵袭性。

图5 IL-11对SF126细胞迁移和侵袭的影响 结晶紫染色×100

A：60 ng/ml IL-11处理SF126细胞对迁移的影响；B：60 ng/ml IL-11处理SF126细胞后对侵袭的影响；C:迁移与侵袭实验数据统计图；1：空白对照组；2：IL-11组；与空白对照组比较：**P<0.01

综上，本研究初步证明在胶质瘤中IL-11表达水平升高，而高表达的IL-11促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。但是IL-11是通过什么分子机制来促进胶质瘤的恶性进展仍没有研究。在之前的研究中，Liang et al[14]证明IL-11通过调节STAT3的表达来改变乳腺癌的迁移侵袭能力。因此在之后的研究中，课题组将深入探讨IL-11促进胶质瘤增殖和侵袭能力的具体分子机制，为探索以IL-11为靶点的分子免疫治疗提供新的思路和方法。