阿托伐他汀对糖尿病心肌梗死大鼠视网膜及心肌血管新生双向性研究

冯晓晶，刘少奎

他汀类药物在临床被广泛用作冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的预防用药，近年来其调脂外作用越来越多被人们发现并研究，他汀类药物可改善内皮功能，抑制血管平滑肌细胞迁移和增殖，减少泡沫细胞形成，抑制巨噬细胞黏附和分泌，抑制血小板聚集、提高纤溶活性，他汀类药物还可以促进内皮祖细胞（EPCs）的动员、迁移以及分化，有利于改善EPCs功能，促进缺血区域血管新生作用。而在糖尿病（DM）患者中，视网膜的缺血和新生血管形成是增生期糖尿病视网膜病变的主要病理生理基础，眼内新生血管常导致玻璃体出血、视网膜脱离、新生血管性青光眼等，是导致视力严重损害甚至失明的重要原因。而阿托伐他汀在促进血管新生和抑制血管新生本身是矛盾的，本研究就旨在探讨阿托伐他汀在促进心肌梗死（心梗）心肌组织血管内皮生长因子（VEGF）及抑制糖尿病视网膜VEGF蛋白表达的双向性作用，并阐述其机制，为临床治疗提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物实验SD雄性大鼠100只，6～8周龄，体重200～250 g，购自大连医科大学实验动物中心。3月龄，所有大鼠均先适应性喂养3 d。3 d后开始建立急性心肌梗死模型，建立急性心肌梗死（AMI）模型成功后随机选择25只做糖尿病模型。

1.2 急性心肌梗死模型的建立将氯胺酮（2 ml：0.1 g）与速眠新（1.5 ml）按1:2比例混匀，按0.15 ml/250 g肌肉注射，待麻醉好后给予阿托品（5 ml：25 mg）0.01 ml/250 g减少气道分泌物。将麻醉好的SD大鼠仰卧固定在鼠板上，用65 mm大鼠灌胃直针进行气管插管，生理盐水浸湿胸部被毛，用剃毛器剔除胸部被毛，常规消毒，于左侧胸骨缘旁，即两上肢下缘、第五肋间做一斜切口约1 cm（于心脏搏动最强点上一肋间），依次钝性分离于心脏搏动点最强处上一肋间即第三、四肋间钝性剥离肋间肌，打开胸腔，连接呼吸机，调整呼吸频率并设置为60 次/min，潮气量30～40 ml，呼吸比率1:2剪一小块纱布，用生理盐水浸湿，塞进胸腔放置在肺组织之上，以免损伤。用眼科镊子轻轻撕开心包，结扎冠状动脉，结扎深度不小于1 mm，结扎后可见心肌苍白变薄，描计术后2周心电图。关闭胸腔时，用自制的胸腔负压吸引管将胸腔内的空气吸尽，并由助手保持胸腔负压，荷包缝合胸腔逐层缝合前锯肌、胸大肌，在缝合胸大肌时由助手保持胸腔负压，膨肺2次，边抽吸保持胸腔负压边拔出胸腔吸引管，同时勒紧荷包闭合胸腔。逐层缝合深筋膜、浅筋膜，最后缝合皮肤、对皮，用碘酒消毒手术切口区域。将手术后的SD大鼠仰卧位放置于鼠笼中，将舌拉到口唇一边，以免舌后坠窒息。待其苏醒。

造模当天始每天腹腔注射庆大霉素针1次（20000 u/kg），共3 d。动物造模成功后80只SD大鼠剩余50只，随机分为AMI组（造模成功后开始以2.5 mg/250 g剂量的阿托伐他汀溶液灌胃），另25只心肌梗死模型基础上腹腔注射链脲佐菌素成糖尿病心肌梗死（心梗）模型，随机血糖≥16.7 mmol/L认为造模成功，为AMI+DM组（25只）。

1.3 糖尿病模型的建立将25只SD大鼠以链脲佐菌素65 mg/kg的剂量进行腹腔注射。注射后72 h，常规消毒，取尾静脉血测量血糖，以血糖高于16.7 mmol/L作为DM模型成功标准。25只SD大鼠均造模成功，未发生死亡，造模成功后药物干预组开始以2.5 mg/250 g剂量的阿托伐他汀溶液灌胃。正常组SD大鼠30只以同等剂量生理盐水灌胃饲养。

1.4 免疫组化方法检测VEGF表达免疫将摘除的眼球及心肌，置于4%多聚甲醛中固定48 h，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋备用。将包埋好的眼球标本，以平行于视神经矢状轴且以其为平面的视网膜进行连续切片，放于预先用多聚赖氨酸处理的载玻片上，60 ℃温箱烤片过夜。切片用于视网膜VEGF免疫组织化学染色（SP法），显微镜下观察并拍照，每个标本取5张切片，对阳性表达细胞进行计数。SABC法测定，DAB显色。检测方法严格按照说明书操作。显微镜下控制显色，阳性表达信号为棕黄色。PBS代替一抗做阴性对照。每个标本随机选取5张切片，每张切片随机选取5个×400倍数高倍视野，细胞核棕黄着染者为阳性。计数标本的阳性细胞核数量的均值为结果，进行统计学分析。

1.5 统计学处理采用SPSS 17.0统计学软件。统计资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD法。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AMI大鼠模型记录I导联心电图，以结扎部位以下心肌变白、搏动减弱且心电图出现ST段弓背向上明显抬高为造模成功见图1～4，术后可见5 min、1 h、1.5 h可见明显的ST段弓背向上抬高，术后2周可见病理性Q波形成。

2.2 不同组间心肌VEGF蛋白表达情况VEGF免疫阳性反应呈棕黄色沉淀颗粒，正常大鼠心肌VEGF免疫阳性，AMI组大鼠心肌VEGF蛋白免疫阳性表达最强，AMI组VEGF免疫阳性表达于AMI+DM组无差异（P＞0.05）。与正常组相比，AMI组和AMI+DM组VEGF值均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图5）。

2.3 不同组间视网膜VEGF表达情况正常大鼠视网膜VEGF免疫阳性反应仅见于内核层细胞。AMI+DM组大鼠VEGF免疫阳性表达最强，除见于内核层细胞外、节细胞、毛细血管内皮细胞和基底膜也出现VEGF免疫阳性表达，AMI组VEGR免疫阳性表达比AMI+DM组减弱，与正常组无差异（P＞0.05）。与正常组相比，AMI组和AMI+DM组VEGF值均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图6）。

3 讨论

图1 正常心电图

图2 术后即刻5 min

图3 术后1 h

图4 术后2周

图5 不同组织心肌VEGF表达（ng/L）

图6 不同组织视网膜VEGF表达（ng/L）

他汀类药物作为冠心病的预防用药，其调脂外作用如促进内皮祖细胞（EPCs）的动员、迁移以及分化，改善EPCs的功能，促进缺血区域的血管新生[1,2]等越来越受到人们的重视。对于某些缺血性疾病如AMI他汀类药物在血管新生方面的作用意义重大，可是对于DM患者而言，视网膜缺血和新生血管的形成是增生期糖尿病视网膜病变的病理基础，眼内新生血管常导致玻璃体出血、视网膜脱离、新生血管性青光眼等，往往导致视力严重损害甚至失明。在本实验中他汀类药物在促进梗死心肌血管新生的同时抑制了视网膜血管新生，说明他汀类药物有双重效应，目前这方面研究尚少，其双重效应的发挥过程目前尚不明确。

本研究结论：他汀类药物能够促进AMI后心肌新生血管。对于DM大鼠，会减缓视网膜病变程度的进展。在促进AMI心肌血管新生方面可能机制：他汀类药物促进EPCs的动员、迁移、分化，改善EPCs的功能，促进缺血区域的血管新生，周卿等[3]在文献中提到他汀类药物能促进骨髓来源EPCs的动员和分化，提高EPCs的数量和分化、迁移能力，促进缺血组织血管新生。他汀类药物促进VEGF表达，VEGF具有强大的促血管新生作用，而EPCs是VEGF的主要靶细胞，VEGF通过EPCs表达的VEGF受体2（VEGF-2）激活蛋白激酶C发挥促有丝分裂和抗凋亡等作用，有研究显示2～10 min的短暂心肌缺血后可以使心肌细胞内的VEGF升高3～5倍。

应用他汀类药物后，对视网膜的VEGF，并不是表达增加，而是抑制VEGF表达，而对于AMI心肌有促进血管新生的作用，这可能是由于他汀类药物对血管生成的作用具有双重选择性[4]。对视网膜病变有延缓的作用，其机制可能是他汀类药物在DM视网膜病变过程中的作用可能与其抗炎作用有关，研究显示他汀类能降低高敏C反应蛋白（hs-CRP）水平[5]。并且他汀类药物可以抑制细胞因子的释放和全身炎症[6]。杨萍等[7]研究显示辛伐他汀治疗3个月后血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、hs-CRP下降明显。Nagaoka等[8]研究显示，C反应蛋白（CRP）是炎症的标志，也是视网膜病变发展过程中的重要媒介，并提出CRP通过NADPH氧化酶产生过氧化物，活化RhoA/Rho激酶，从而抑制了一氧化氮（NO）介导的视网膜内皮小动脉的扩张，并损伤NO介导的内皮血管活性，潜在地促进了视网膜血管病的发展。而TNF-α是内皮细胞凋亡的有力诱导剂，有研究显示[4]，血清TNF-α水平与DM的严重程度有显著的关联。作者推测，他汀类药物对DM视网膜病变的影响可能是通过其抗炎作用，降低血清TNF-α、hs-CRP从而抑制了视网膜血管增殖过程，延缓其病变过程，但仍需进一步的研究证明。

本研究显示他汀类药物具有器官特异性。对于缺血性疾病，如冠心病一心绞痛、心肌梗死、DM外周血管病变等，他汀类药物的应用增加EPCs的释放，促进缺血区域的血管新生，大量的促血管生成因子的释放将有助于病情的改善[10]；而对于本身的发病机制就是微血管瘤形成、血管增生性疾病而言的视网膜病变，EPCs的释放则不利于疾病的进展，这种情况下他汀类药物的应用结果，得出相反的结论。可以理解为他汀类药物对血管新生的作用是以一种非常“聪明”的方式进行的，可以根据不同的疾病调整作用方式。所以看到他汀类药物有利于DM视网膜病变的治疗，同时可显著降低心脏血管疾病的风险。