多指标综合加权评分法优选消瘿散结合剂的提取工艺*

马晓琨，朱建勇，宋雅楠，张春燕，叶 颖，夏 伟

上海中医药大学附属第七人民医院，上海200137

消瘿散结合剂由丹参、柴胡、制香附、青皮、陈皮、制半夏、莪术、夏枯草、猫爪草共9 味中药组成，为上海市名老中医叶景华教授的经验方，临床应用已有五年以上，主治“活血化瘀、化痰散结、疏肝理气”，对甲状腺结节具有显著改善效果。本研究拟将上海市第七人民医院内分泌科运用于临床的消瘿散结汤研制成院内制剂——消瘿散结合剂，使之规范化应用于临床，保证药物的安全性、稳定性、有效性和可控性。本研究采用正交试验设计，以丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸及出膏率为考察指标[1-3]，对料液比、提取时间、提取次数等因素进行考察，优选消瘿散结合剂的最佳提取工艺，提高消瘿散结合剂的提取效率。

1 材 料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Agilent 1260），美国安捷伦公司；电子天平（CPA225D），北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2 药物与试剂

对照品：丹酚酸B（批号：111562-201716）、橙皮苷（批号：110721-201818）、迷迭香酸（批号：111871-201706），均购于中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯；水为超纯水。

丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，产地山东；柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根，产地陕西；香附Cyperus rotundus L.的干燥根茎，产地海南；青皮Citrus reticulata Blanco 及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮，产地浙江；陈皮Citrus reticulata Blanco 及其栽培变种的干燥成熟果皮，产地湖北；半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥块茎，产地甘肃；莪术Curcuma Kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang 的干燥根茎，产地广西；夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，产地河南；猫爪草Ranunculus ternatus Thunb.的干燥块根，产地河南。以上药材均购自上海万仕诚国药制品有限公司，经验证符合2015 版《中国药典》相关规定。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：安捷伦ZORBAX Elipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：以0.1%磷酸水为流动相A，以甲醇为流动相B，洗脱程序见表1；流速：1.0 mL·min-1；柱温：28 ℃；检测波长：286 nm；进样量：10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸对照品适量，加甲醇溶解，分别配制成浓度为2048 μg·mL-1、712 μg·mL-1、108 μg·mL-1混合对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取一日处方量药材共111 g，加8 倍量水，煎煮2 次，每次1 h，合并滤液，减压浓缩至50 mL，精密吸取1 mL 浓缩液，加50%甲醇溶液定容至5 mL，摇匀，离心，取上清液，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性溶液的制备 称取除丹参、青皮、陈皮、夏枯草之外的各药材，按照“2.1.3”项下方法，制备阴性溶液。

2.2 专属性试验

分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各10 μL，按“2.1.1”项色谱条件进行测定，3 种指标性成分与其相邻的色谱峰分离系数均大于1.5，并且各组分互不干扰，理论塔板数符合要求，专属性良好。见图1。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液0.1、0.125、0.25、0.5、0.75、1 mL 置1 mL 量瓶中，前5 位溶液量加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取10μL 注入液相色谱仪，按照“2.1.1”项色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得各组分线性方程、相关系数、线性范围，分别为Y丹酚酸B=253.41X-1.547 4，r=0.999 9，2.048～20.48 μg；Y橙皮苷=461.92X-0.842 4，r=1.000 0，0.712～7.12 μg；Y迷迭香酸=648.16X＋1.571 4，r=1.000 0，0.108～1.08 μg。在相应进样范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液5 μL，按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的RSD 值分别为0.37%、0.33%、0.49%。表明仪器的精密度良好。

2.3.3 重复性试验 按“2.1.3”项下的方法分别制备6 份供试品溶液，分别进样10 μL，记录丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的峰面积，计算丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的相对标准偏差（RSD）值分别为2.60%、2.97%、2.54%。表明方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取“2.1.3”项下制备的供试品溶液适量，分别于室温下放置0、4、8、10、24、32 h。按“2.1.1”项下色谱条件进样10μL，测定峰面积，计算丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的RSD 值分别为0.80%、1.74%、0.85%。表明供试品溶液在32h 内稳定。

2.3.5 加样回收率试验 取已知指标成分含量的供试品溶液适量，在线性范围内分别加入一定量的丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸对照品溶液；共6 份。按“2.1.1”项下色谱条件测定含量，结果丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸平均回收率分别为104.6%、99.94%、95.10%；RSD 分别为1.41%、1.03%、2.24%。说明本方法的回收率良好。

2.4 单因素试验

2.4.1 料液比对提取率的影响 称取一日处方量药材约111 g，共6 份，补足吸水量，料液比分别按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 煎煮1 次，每次0.5 h，煎液浓缩至50 mL。按“2.1.3”项下方法分别制备供试品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进行丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的含量测定，结果见表2。

表2 料液比对提取率的影响结果

实验显示，1∶4、1∶6 提取两种主成分含量偏低；1∶12 和1∶14 提取效果相当；选择1∶8、1∶10、1∶12 作进一步正交试验考察。

2.4.2 提取时间对提取率的影响 称取一日处方量药材约111 g，共5 份，补足吸水量，加8 倍水，煎煮1 次，分别煎煮0.5、1、1.5、2、2.5 h，煎液浓缩至50 mL。按“2.1.3”项下方法分别制备供试品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进行丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸含量测定，结果见表3。

实验显示，煎煮0.5 h 的与1 h 提取效果较佳；煎煮1.5 h 的提取效果与2 h 相当；且合剂君药的主成分丹酚酸B 随着煎煮时间的延长显著下降，2.5 h时较低。故选择0.5、1、1.5 h 提取时间作进一步正交试验考察。

表3 提取时间对提取率的影响结果

2.5 正交试验

2.5.1 正交试验设计 以消瘿散结合剂处方药材浓缩提取液中丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的含量及浸膏得率为指标，采用L9（34）正交实验考察料液比、提取时间、提取次数等因素，优选最佳的提取工艺，因素水平表见表4。

表4 正交试验因素水平表

2.5.2 正交试验方案 称取一日处方量药材约111g，按正交设计各组的方案进行提取，合并滤液，减压浓缩至100 mL，精密吸取1 mL 浓缩提取液，加50%甲醇溶液定容至5 mL，摇匀，离心，取上清液，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，获得各组供试品溶液；按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算各供试品溶液中丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的含量，结果见表5。

表5 消瘿散结合剂提取工艺的L9（34）正交试验设计与结果

2.5.3 干膏收率的测定 精密量取各组浓缩提取液25 mL，分别置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置于100 ℃的烘箱中干燥至恒重，取出，放干燥器中冷却后，迅速称定重量，计算出膏率，其结果见表5。

2.5.4 正交试验结果分析 根据各因素对提取工艺影响大小来分配权重系数，即丹酚酸B 含量（W1）的权重系数为0.3，橙皮苷含量（W2）的权重系数为0.2，迷迭香酸含量（W3）的权重系数为0.2，干浸膏收率（W4）的权重系数为0.3，按此进行加权求和，综合评分：W（%）=0.3W1/Wmax1＋0.2W2/Wmax2＋0.2W3/Wmax3＋0.3W4/Wmax4。综合加权评价结果见表5 和表6。

表6 方差分析表

由表6 分析可知，各因素对综合评分的影响依次为C>A>B，最优提取工艺为C2A2B2，即1∶10，1 h，2次。故确定最佳提取工艺为：加10 倍水，煎煮1 h，提取2 次。

2.6 验证实验

称取一日处方量药材约111 g，共3 份，按照确定的最佳提取工艺C2A2B2进行验证实验，即加入10倍量的水，提取2 次，每次1 h。提取液合并浓缩至100 mL，按照“2.5.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件测定丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的含量，实验结果见表7。综合评分为96.74%～99.99%，显示该工艺准确可靠，可行性好。

表7 验证实验结果

3 讨论

本文选择消瘿散结合剂君药丹参中的丹酚酸B，臣药青皮、陈皮中的橙皮苷，佐药夏枯草中的迷迭香酸作为含量检测指标，其含量测定方法主要参考《中国药典》2015 年版（一部）相关药材项下“含量测定方法”[4]。3 种指标性成分的检测波长在药典中分别为330 nm、283 nm 和286 nm，但通过实验发现，采用波长286 nm，能很好地检测到4 味药材中主成分的含量，故采用此波长来检测消瘿散结合剂样品，同时借鉴相关文献[5-7]作了优化处理。

甲状腺结节属于中医瘿病，其主要病机为血瘀、气郁、痰凝。前期临床研究结果表明，消瘿散结合剂对甲状腺结节有显著改善效果，安全性良好，具有良好的临床意义。本次采用多指标综合加权评分法，优化消瘿散结合剂提取工艺，确定最佳提取方法，为消瘿散结合剂的开发及工业化生产提供了前期实验基础。