气相色谱法测定氟比洛芬酯中杂质1-溴乙基乙酸酯及2-溴乙基乙酸酯的限度

徐家根，浦迎秋*，顾琦欣，傅辰超

1南京大学医学院附属口腔医院，南京市口腔医院 药学部，南京 210008;2南京优科制药有限公司，南京210009

氟比洛芬酯[1]作为一种非甾体类抗炎药，能降低神经敏感程度及痛觉冲击，发挥镇痛效果。氟比洛芬酯的合成过程中会使用到1-溴乙基乙酸酯作为起始物料，而2-溴乙基乙酸酯是合成的副产物存在于氟比洛芬酯中，这两种物质属于烷基卤化物类化合物，具有卤代烷烃类结构，是潜在的基因毒性杂质[2]，需要建立有效的方法测定氟比洛芬酯中上述两种杂质限度，以保证该药符合质量要求。

由于1-溴乙基乙酸酯和2-溴乙基乙酸酯两种物质属于烷基卤化物类化合物不存在紫外吸收，无法使用常规的HPLC 法进行检测。而气相色谱法是利用气体作流动相的色层分离分析方法，气化的试样被载气（流动相）带入色谱柱中，柱中的固定相与试样中各组分分子作用力不同，各组分从色谱柱中流出时间不同，组分彼此分离。根据峰的高低和面积大小，可对化合物进行限度或定量分析。适用于易挥发有机化合物的定性、定量分析。气相色谱法中的电子俘获检测器（ECD）是灵敏度较高的气相色谱检测器[3]，其只对电负性的化合物有信号，待测物电负性越强，灵敏度越高，对于中性（无负电性）化合物，如烷烃、环烷烃，则无信号或信号非常小。相比气相色谱仪常用的火焰离子化检测器（FID），测定含有卤族元素的有机化合物，ECD 优势非常明显，所以选择该检测器（ECD）检测氟比洛芬酯中1-溴乙基乙酸酯和2-溴乙基乙酸酯的限度更为准确、灵敏。

1 仪器与药品、试剂

GC-2014 气相色谱仪，配制电子捕获检测器（ECD）、直接进样器AOC-20i（岛津公司）；BPZ11D型电子天平（Sartorius）。

供试品：氟比洛芬酯（批号：20190501、20190502、20190503，南京优科制药有限公司）；对照品：1-溴乙基乙酸酯（纯度：95.0%，加拿大TRC 公司）；2-溴乙基乙酸酯（纯度：97.9%，美国Sigma 公司）。正己烷（Merck，HPLC 级）。

2 方法与结果

2.1 限度确认及各溶液浓度设定

根据ICH M7 指导原则，依照短于生命周期的可接受摄入量原则，详情见表1。采取最为严格的控制条件，设定杂质可接受摄入量为1.5 μg·d-1。根据氟比洛芬酯注射液说明书可知，其日使用剂量为50mg，由此计算出1-溴乙基乙酸酯及2-溴乙基乙酸酯在供试品中限度值均为0.003%。为保证检验的重现性与准确度，选取1-溴乙基乙酸酯定量限2 倍的浓度作为对照品溶液浓度，故确定其为0.06 μg·mL-1，依据限度为0.003%，确定供试品溶液浓度为2 mg·mL-1。根据分析天平分度值要求及操作规定，本检验方法设计供试品取样量为20 mg。

表1 短于生命周期的可接受摄入量

2.2 色谱条件

采用毛细管气相色谱法。色谱柱：Agilent（DB-1701，60 m×0.53 mm×0.25 μm）；载气：氮气；起始温度为50 ℃，维持3 min。以每分钟2 ℃的速率升温至80 ℃，维持5 min，以每分钟5 ℃的速率升温至100 ℃，再以每分钟20 ℃的速率升温至180 ℃，维持3 min；进样口温度：150 ℃；检测器温度：300 ℃；柱流量：4.0 mL·min-1；进样量：1 μL。

测定法：精密量取对照品溶液和供试品溶液各1 μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。

2.3 溶液制备

对照品贮备溶液：取1-溴乙基乙酸酯与2-溴乙基乙酸酯对照品适量，精密称定，加正己烷溶解并定量稀释制成每1 mL 中约含1-溴乙基乙酸酯与2-溴乙基乙酸酯均为6 μg 混合储备溶液。

对照品溶液：精密量取对照品贮备溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，加入正己烷稀释至刻度，摇匀。

供试品溶液：取本品20 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。

空白溶剂：正己烷。

2.4 专属性试验

取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液各适量，按“2.2”项下色谱条件测定，通过图1 可知，空白溶剂及其他杂质均不干扰本品中1-溴乙基乙酸酯和2-溴乙基乙酸酯的测定，且保留时间分别为10.572 min 及15.218 min，两峰之间分离度为30.22，两杂质的理论板数分别为95388 及126121。该方法专属性良好，适合本品中两杂质的限度测定。

2.5 检测限及定量限

取“2.3”项下对照品贮备溶液适量，分别用正己烷逐级稀释后，量取1 μL，注入气相色谱仪，记录色谱图，按信噪比10∶1 计算定量限，按信噪比3∶1 计算检测限。结果1-溴乙基乙酸酯与2-溴乙基乙酸酯的定量限及检测限分别为0.031 880、0.008 444 μg·mL-1；0.006 237、0.003 119 μg·mL-1。

2.6 线性范围

取“2.3”项下对照品贮备溶液适量，用正己烷稀释制成每1 mL 中约含1-溴乙基乙酸酯与2-溴乙基乙酸酯均为0.6 μg 的溶液，精密量取上述溶液0.4、0.8、1.0、1.2、1.5 mL，分别置10 mL 量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为两杂质对照品系列溶液。精密量取系列溶液各1 μL，注入气相色谱仪，记录色谱图，以浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，并计算得两者的回归方程分别为Y1=2.14×103X1-6.027 0，r=0.997 1；Y2=2.80×103X+2.077 7，r=0.997 4。结果表明，1-溴乙基乙酸酯浓度在0.024 20 μg·mL-1～0.090 76 μg·mL-1范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系（r=0.997 1）；2-溴乙基乙酸酯浓度在0.009 397 μg·mL-1～0.070 47 μg·mL-1范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系（r=0.997 4），线性关系良好。

2.7 进样精密度试验

取“2.3”项下对照品溶液，精密量取1 μL，注入气相色谱仪，记录色谱图，连续进样6 次，计算各溶液峰面积的相对标准偏差。结果表明，1-溴乙基乙酸酯对照品溶液浓度的进样精密度为6.8%；2-溴乙基乙酸酯对照品溶液浓度的进样精密度为5.9%；RSD 均小于10%。精密度能满足测定要求。

2.8 重复性试验

称取氟比洛芬酯约20 mg，共6 份，采用拟定的测定方法分析。结果表明，在样品中，1-溴乙基乙酸酯及2-溴乙基乙酸酯未检出，方法重复性良好，能满足本品杂质限度的测定要求。

2.9 耐用性试验

分别考察了不同柱温、进样口温度、流速对氟比洛芬酯中1-溴乙基乙酸酯及2-溴乙基乙酸酯限度测定的影响，见表2。由表2 可知，上述因素在一定范围内变化对氟比洛芬酯中两杂质的分离度影响不大，两杂质峰的分离度均能满足本品杂质限度测定的要求，且供试品在不同的色谱条件下两杂质均未检出。

表2 耐用性试验结果

2.10 回收率试验

分别称取氟比洛芬酯（批号：20190501）20 mg共9 份，精密称定，分别置于10 mL 量瓶中，根据“2.8”项下两杂质未检出的结果，因此加样回收率试验需向供试品中加入对照品储备液0.8、1.0、1.2 mL，用正己烷溶解稀释并定容至刻度，摇匀，作为待测溶液，按照“2.2”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，按外标法计算测得量。1-溴乙基乙酸酯与2-溴乙基乙酸酯的平均回收率及RSD 分别为976.69%、3.4%；101.3%、4%。回收率均在80%～120%。说明本方法可以用于氟比洛芬酯原药杂质限度的测定。

2.11 供试品测定

取3 批供试品（批号：20190501、20190502、20190503）各适量，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，计算氟比洛芬酯中1-溴乙基乙酸酯与2-溴乙基乙酸酯的杂质量。结果表明，3 批供试品中两杂质均未检出，限度达标。

3 小 结

氟比洛芬酯为氟比洛芬的前体药物，用于手术后及各种癌症的镇痛，其优点在于没有中枢抑制作用，不影响处于麻醉状态患者的苏醒。为保证氟比洛芬酯原药质量，有必要建立合理且有效的分析方法定量检测其杂质，使杂质不得超过限度要求。本文采用气相色谱法测定药物中烷基卤化物类基因毒性杂质，检测具有选择性好、灵敏度高的优点。