沙利度胺调控PD-L1 抑制HT-29 结肠癌细胞的作用及机制研究

周宋汇，沈培亮，汪瑞辰*

1 江苏省肿瘤医院，江苏省肿瘤防治研究所，南京医科大学附属肿瘤医院，南京 210009；2 伊尔瑞生物科技（江苏）有限公司,南京211500

我国结肠癌的患者逐年增多，且呈现年轻化的态势；结肠癌具有发病隐秘、致死率极高的特点[1，2]，亟待寻求特效的治疗药物。随着肿瘤免疫疗法研究的深入，从这一角度入手研发有效药物有望成为潜在治疗肿瘤的手段[3]。目前免疫检查点程序性死亡受体-1（programmed death receptor-1，PD-1）/程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）信号通路是研究的热点[4，5]。肿瘤细胞表面表达的PD-L1 与体内淋巴细胞表面的PD-1 受体相结合之后，能够诱导后者发生免疫功能的丧失甚至凋亡，进而出现免疫逃逸[6]。研究表明，结肠癌高表达PDL1 与结肠癌不良预后密切相关[7]。近年来，临床和基础研究表明，沙利度胺对多种肿瘤细胞具有杀伤作用[8]，确有潜在的抗肿瘤效应；但是其对HT-29 结肠癌细胞的作用机制尚不清楚。因此本研究从肿瘤细胞免疫检查点PD-L1 表达角度探讨沙利度胺抗肿瘤的机制，以期为临床和实验研究提供参考。

1 材 料

1.1 细胞株

人结肠癌肿瘤细胞HT-29 细胞株，购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.2 药品和试剂

沙利度胺（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，纯度98%，批号：RCD105541）；胎牛血清（上海吉泰依科赛生物科技有限公司，批号：11H228）；CCK-8 试剂盒（日本DOJINDO 公司，批号：DV652）；RPMI-1640 细胞培养基（美国Gibco 公司，批号：1855639）；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份公司，批号：20190318）；Anti-PD-L1 APC 流式抗体（Ebioscience 公司，批号：673DH93）；c-Myc、STAT3 和HIF-1 一抗（美国CST 公司）；β-Actin 一抗和兔二抗（南京Bioworld 公司）；其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器

Multiskan 型酶标仪、3110 型CO2培养箱（美国Thermo 公司）；Accuri C6 型流式细胞分析仪（美国BD 公司）；PowerPacBasic 型电泳仪及成像系统（美国Bio-rad 公司）。

2 方 法

2.1 CCK-8 方法检测沙利度胺对HT-29 肿瘤细胞增殖能力的影响

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培养基培养HT-29 肿瘤细胞，处于对数生长期的HT-29 细胞经消化和计数后以5×103个每孔接种于96孔无菌细胞培养板中，将培养板置于37 ℃含5%CO2的培养箱中进行培养12 h，使其贴壁。沙利度胺按照预先设置的浓度进行加药（0、10、20、40、80、160、320 μmol·L-1）继续作用48h，每个药物浓度设置6 个复孔。作用结束后，每孔分别加入10 μL CCK8 试剂，置于培养箱继续培养2 h，培养计数后将细胞培养板于酶标仪450 nm 波长处检测其吸光度值（A），并计算其增殖抑制率。

增殖抑制率（%）=（A药物孔-A空白孔）/（A对照孔-A空白孔）×100%。

2.2 流式细胞术检测沙利度胺诱导HT-29 结肠癌细胞凋亡

取处于对数生长期的HT-29 肿瘤细胞，经消化和计数后,以2×105个每孔接种于6 孔无菌细胞培养板中，将培养板置于37 ℃含5% CO2的培养箱中进行培养24 h 后,加入不同浓度的沙利度胺（0、20、40、80 μmol·L-1）作用48 h，每个浓度设置6 个复孔。待作用完成后，采用不含EDTA 的胰酶消化液小心消化肿瘤细胞，无菌磷酸缓冲液（PBS）清洗细胞两遍，每孔收集1×105个肿瘤细胞加入100 μL 的缓冲液重悬细胞，加入Annexin V 5 μL 混匀后，加入碘化丙啶（PI）5 μL，混匀，室温、避光、反应15 min 后，用流式细胞仪检测HT-29 结肠癌细胞凋亡。

2.3 流式细胞术检测HT-29 结肠癌细胞表面PD-L1 表达

取处于对数生长期的HT-29 肿瘤细胞，经消化和计数后，以2×105个每孔接种于6 孔无菌细胞培养板中，将培养板置于37 ℃含5% CO2的培养箱中进行培养24 h，加入不同浓度的沙利度胺（0、20、40、80 μmol·L-1）作用24 h，每个浓度设置6 个复孔。待作用完成后，采用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化液小心消化肿瘤细胞，无菌PBS 清洗细胞两遍，离心、计数肿瘤细胞，调整其浓度为5×106mL，每孔分别加入5 μL 的Anti-PD-L1 APC 流式抗体，吹打混匀，室温避光孵育15 min，用流式细胞仪检测HT-29 肿瘤细胞表面PD-L1 的表达。

2.4 Western Blot 法检测c-Myc、STAT3、HIF-1蛋白的表达

取处于对数生长期的HT-29 肿瘤细胞，经消化和计数后，以2×105个每孔接种于6 孔无菌细胞培养板中，将培养板置于37 ℃含5% CO2的培养箱内进行培养24 h，加入不同浓度的沙利度胺（0、20、40、80 μmol·L-1）作用24 h，PBS 清洗细胞3 次，加入RIPA 细胞裂解液于冰上充分裂解肿瘤细胞，以12000g离心取上清液，加入上样缓冲液（5×loading buffer，1∶4），100 ℃变性10 min，样品保存于-80 ℃冰箱中待用。蛋白定量后，每孔蛋白样品上样25 μg，电泳条件为40 A、90 min，转膜条件为110 V、80 min。转膜封闭后分别加入蛋白一抗（c-Myc、STAT3、HIF-1 和β-Actin）置于4 ℃冰箱中孵育过夜，洗膜后室温孵育兔二抗2 h，TBST 洗涤5 次，采用ECL 发光液显影。以Image J 软件进行蛋白定量统计。

2.5 统计方法

采用Graph Pad Prism 5 软件作图分析，采用SPSS19.0 软件对数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Student-Newman-Keuls post hoc 检验进行组间比较。P<0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 沙利度胺对HT-29 结肠癌细胞增殖的影响

经不同浓度的沙利度胺溶液作用于HT-29 结肠癌细胞48 h 后，CCK-8 实验结果显示，沙利度胺在浓度为40、80、160、320 μmol·L-1时能够明显抑制结肠癌细胞HT-29 的增殖；与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；且其IC50为85.37 μmol·L-1。结果表明，沙利度胺对HT-29 肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用，还具有一定的剂量依赖性。见图1。

3.2 沙利度胺对HT-29 结肠癌细胞凋亡的影响

经不同浓度的沙利度胺作用后，流式细胞术结果显示，沙利度胺在浓度为20、40、80 μmol·L-1时能够明显促进结肠癌细胞的凋亡；与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果表明，沙利度胺能够促进HT-29 结肠癌细胞的凋亡。见图2。

3.3 沙利度胺对HT-29 结肠癌细胞PD-L1 表达的影响

经不同浓度的沙利度胺作用后，流式细胞术结果显示，沙利度胺在浓度20、40、80 μmol·L-1时能够明显减少HT-29 结肠癌细胞PD-L1 的表达；与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图3。

3.4 沙利度胺对HT-29 结肠癌细胞c-Myc、STAT3、HIF-1 信号的影响

对沙利度胺减少HT-29 结肠癌细胞PD-L1 表达的机制进行探讨，鉴于c-Myc、STAT3 和HIF-1信号能够促进HT-29 肿瘤细胞PD-L1 的表达。通过Western Blot 检测发现，沙利度胺在浓度为20、40、80 μmol·L-1时，能够明显减少HT-29 结肠癌细胞中c-Myc、STAT3 和HIF-1 蛋白的表达含量；与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。表明沙利度胺可能通过抑制c-Myc、STAT3 和HIF-1 蛋白表达，从而减少HT-29 结肠癌细胞PD-L1 的表达发挥抗肿瘤的效应。见图4。

4 讨论

结肠癌发病率逐年升高且易发生淋巴和远处转移，其预防和治疗是世界性难题，探寻切实有效的治疗药物和策略是当前的攻关重点。癌细胞通过多种机制促进增殖转移并逃避机体的免疫伤害，PD-L1 是癌细胞表面表达的重要分子，能够与免疫细胞表面的PD-1 分子相结合、抑制免疫细胞功能，使癌细胞免于免疫细胞识别和伤害，最终实现免疫逃逸。当前针对PD-L1 分子已经开发出一系列单抗药物，成功用于临床并取得了良好的治疗效果[9]，因而探寻能够靶向肿瘤细胞表面PD-L1 分子的药物显得极有意义。沙利度胺商品名“反应停”，因其在治疗妊娠反应时所产生的强致畸性而广为熟知。近年来，许多文献指出，沙利度胺具有潜在的抗肿瘤特性，已经应用于多种肿瘤的治疗[10]。本研究从肿瘤免疫检查点角度对其机制进行探讨。实验显示，沙利度胺在体外能够明显抑制HT-29 结肠癌细胞的增殖，促进癌细胞发生凋亡，表明其体外抗结肠癌细胞的作用。进一步采用流式细胞术对癌细胞表面PD-L1 的表达进行检测发现，沙利度胺能够减少癌细胞表面PD-L1 的表达水平，表明它是潜在的增强抗肿瘤免疫作用的药物，其作用机制值得深入的研究。通过对促进癌细胞PD-L1 分子表达的上游信号检测发现，沙利度胺能够抑制结肠癌细胞上游c-Myc、STAT3、HIF-1 信号分子的表达[11]，表明其可能通过抑制信号分子减少癌细胞表面PD-L1 的表达而发挥抑制结肠癌细胞的作用。

综上所述，本研究从体外细胞角度实验发现，沙利度胺具有潜在的抗结肠癌的作用，其机制可能与抑制c-Myc、STAT3、HIF-1 信号分子减少癌细胞表面PD-L1 的表达有关。后续实验部分，将采用免疫正常和免疫缺陷小鼠模型，研究沙利度胺的抗肿瘤效应及其作用机制。