LC-MS/MS 法测定老年房颤患者血浆中利伐沙班的浓度

周芳妍，王曦晗，吴 芳，蔡 凡，许倍铭，陈 冰*

上海交通大学医学院附属瑞金医院 1 药剂科;2 老年科，上海200025

利伐沙班是一种直接作用于Xa 因子的口服抗凝药（direct oral anticoagulant，DOAC）。2011 年经美国FDA 批准用于预防房颤、中风以及作为深静脉血栓和肺栓塞形成的二级预防药物[1]。但随着利伐沙班的广泛使用，与其出血风险相关的不良反应也明显增加。有研究表明，使用利伐沙班非瓣膜性房颤患者大出血事件为3.6%[2]。意大利国家药物警戒网络记录了2013～2017 年可疑不良反应（ADR）共有与利伐沙班相关的报告1674 份[3]。鉴于利伐沙班药动学存在显著个体差异[4]，认为对其进行治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）具有一定临床价值[5]。目前国外已有文献报道了利伐沙班主要采用LC-MS/MS 法测定其浓度，并对患者药动学进行了研究[6-7]，国内对利伐沙班TDM 及药动学研究尚未见报道。本研究通过建立LC-MS/MS 法测定老年房颤患者血浆中利伐沙班的浓度，以利于进一步探讨利伐沙班在患者人群中的药动学与药效学之间的关系，为临床的个体化治疗提供依据。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

API4000 型三重四级杆质谱仪（美国Applied Biosystems 公司）；BS224S 型精密天平（德国Sartorius 公司）。

1.2 药品与试剂

利伐沙班对照品批号：14-XJZ-49-1，纯度：>98%，规格：2 mg；利伐沙班-D4 内标批号：9-JHY-173-5，纯度：>98%，规格：1 mg，均为Toronto Research Chemicals 公司产品；甲醇、乙腈为色谱纯；试验用水为蒸馏水。

空白血浆来源于临床试验健康志愿者剩余标本，血浆分离后于-80 ℃冰箱中保存备用。

2 方 法

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B）（采用梯度洗脱:0～0.5 min，A∶B 为90∶10；0.5～4 min，A∶B 为20∶80；4～8.5 min，A∶B 为20∶80；8.5～9 min，A∶B 为90∶10；9～10 min，A∶B 为90∶10）；流速：0.3 mL·min-1；柱温为40 ℃。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾离子化电离源（ESI），正离子方式检测；离子喷射电压：5500 V；离子源温度500 ℃；GS1 压力：275.8 kPa；GS2 压力：275.8 kPa；扫描方式为多重反应监测（MRM）；利伐沙班和内标利伐沙班-D4 的离子对分别为m/z 436.4 →m/z 145.2 和m/z 440.7→m/z 145.3；解簇电压（DP）分别为：134.78 eV 及145.06 eV；碰撞能量（CE）分别为：36.18 eV 和40 eV。碰撞室射出电压（CXP）电压分别为：12.25 V 和7 V。

2.2 对照品溶液的配制

精密称取利伐沙班对照品2.0 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成两份浓度均为0.2 mg·mL-1的利伐沙班储备液，用于标准曲线与质控品配制。用50%甲醇-水依次稀释利伐沙班储备液，得到利伐沙班浓度分别为50、100、200、500、1000、2000、5000 ng·mL-1标准曲线溶液。另取对照品储备液稀释至80、400、4000 ng·mL-1的低、中、高浓度的质控工作液。于-20 ℃保存备用。

2.3 内标溶液的配制

精密称取利伐沙班-D4 内标约1.0mg，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度为0.1 mg·mL-1的利伐沙班-D4 储备液。用乙腈配制成浓度为500 ng·mL-1的内标溶液，于4 ℃冰箱内保存备用。

2.4 标准血浆样品

分别取不同浓度的对照品工作液各10 μL，加入空白血浆100 μL，最终配制成系列浓度为5、10、20、50、100、200、500 ng·mL-1的利伐沙班标准血浆样品。另取不同浓度的质控品工作液各10μL，加入空白血浆100 μL，最终配制成系列浓度为8、40、400 ng·mL-1的利伐沙班质控血浆样品。

2.5 血浆样品处理

取100 μL 血浆样品至1.5 mL 离心管中，加入10 μL 50%甲醇-水混匀，加入200 μL 含内标溶液（500 ng·mL-1）乙腈沉淀剂，涡旋振荡5 min，19419×g离心10 min，吸取上清液置于进样管中，取5 μL 进样，按“2.1”项下检测条件进行LC-MS/MS 分析。

2.6 患者标本检测

选取我院老年科3 名服用利伐沙班片（拜瑞妥，10 mg/片，批号：BXJ7VR1，拜耳公司）房颤患者，除利伐沙班外，近期均未服用华法林、Xa 因子抑制剂、肝素类抗凝剂等药物。服药剂量为20 mg qd。患者服药达稳态后，在给药前与给药后2 h，经肘静脉取血，3.0 mL 转移至乙二胺四乙酸（EDTA）处理的抗凝管中，3000 g 离心10 min，分离的血浆于-80 ℃冰箱中保存，按“2.5”项血浆样品处理后进样，采用建立的LC-MS/MS 法测定血浆中利伐沙班峰的血药浓度。

3 结果

3.1 质谱扫描

将利伐沙班和利伐沙班-D4 储备液分别用50%甲醇-水稀释成100 ng·mL-1的溶液，采用微量注射泵以10 μL·min-1的恒定速度泵入质谱系统，进行碎片离子分析，相应的二级全扫描质谱图见图1。

3.2 专属性试验

分别取空白溶液、50%甲醇-水基质、标准血浆样品（加入内标溶液）和患者用药后血浆（加入内标溶液）样本，按“2.4”项下方法处理，按“2.1.1”项下色谱条件测定，色谱图见图2。

利伐沙班和内标利伐沙班-D4 保留时间分别为5.55 min 和5.57 min，峰形良好，血浆中内源性物质不干扰利伐沙班及内标的测定。

3.3 标准曲线及定量下限

取“2.4”项下系列标准血浆样品，按“2.5”项下方法处理后进行分析。以待测物浓度（ng·mL-1）为横坐标X，以利伐沙班与利伐沙班-D4 的峰面积比值为纵坐标Y，用加权（W=1/X）最小二乘法进行回归运算，得到回归方程Y=1.11×10-2X-1.12×10-3，r=0.999 7（n=5）。表明利伐沙班在5～500 ng·mL-1范围内线性关系良好。最低定量下限为5 ng·mL-1，连续测定5份样本，准确度为112.8%，精密度的RSD 为4.49%。

3.4 精密度和准确度试验

按照“2.2”项下方法配制利伐沙班低、中、高（8、40、400 ng·mL-1）3 个浓度的质控血浆样品。按“2.4”项下方法处理样本，各浓度均配制5 份进样分析，连续测定3 天。根据当日标准曲线测算质控血浆样本的浓度，计算日内及日间精密度。见表1。

3.5 提取回收率和基质效应

表1 血浆中利伐沙班方法精密度和准确度测定结果

按照“2.2”项下方法，分别配制利伐沙班低、中、高（8、40、400 ng·mL-1）3 个浓度的质控血浆样本，按“2.4”项下方法操作，每个浓度平行测定5 份样本，得峰面积A；将人空白血浆按“2.5”项下方法处理，经离心后取上清液，加入适量利伐沙班对照品溶液，配制成浓度为8、40、400 ng·mL-1的质控样品，涡旋混合后进样得峰面积B，每个浓度平行测定5 份样本；在50%甲醇-水中加入适量利伐沙班对照品溶液，配制成质量浓度为8、40、400 ng·mL-1的质控样品，涡旋混合后进样得峰面积C，每个浓度平行测定5 份样本。利伐沙班提取回收率（%）=A/B×100%，基质效应（%）=B/C×100%。计算得到提取回收率在90.8%～101.3%，基质效在95.2%～103.3%。见表2。

表2 利伐沙班提取回收率和基质效应（n=5，）

表2 利伐沙班提取回收率和基质效应（n=5，）

同法计算内标利伐沙班-D4 的提取回收率和基质效应分别为92.2%～99.5%和95.8%～98.9%。

3.6 稳定性考察

用空白血浆配制利伐沙班低、中、高（8、40、400 ng·mL-1）3 个浓度的质控血浆样本，每个浓度平行配制5 份。血浆样本分别在室温放置12 h、反复冻融3 次和-20 ℃冻存30 d，按照“2.5”项下方法处理后进样分析，计算浓度。结果见表3。这表明在上述考察条件下，利伐沙班稳定性良好。

3.7 方法应用

3 位老年科房颤患者服用利伐沙班后，稳态谷浓度分别为30.0、14.1、38.5 ng·mL-1，而给药后2 h的峰浓度分别为119、94.3、149ng·mL-1。上述结果存在一定个体差异，后续研究有待进一步扩大样本量。

表3 血浆中利伐沙班的稳定性（n=5）

4 讨论

目前大多研究采用LC-MS/MS 法，以ESI 正离子作为电离模式检测。Baldelli S 等[8]采用一种固相萃取法，较好地排除了血浆中的干扰；但是操作步骤更为复杂，成本也较高。另一种处理方法是蛋白沉淀，操作较为简便，易于批量处理，是目前LCMS/MS 法分析生物样本的常用处理方法。

本文试验了不同pH 环境下利伐沙班的峰型，最后选择0.1%甲酸水-甲醇作为流动相，采用梯度洗脱的方式，检测物质峰型良好，且避免了血浆中内源物质的干扰。选用乙腈作为沉淀剂进行蛋白沉淀，且与以前建立的检测方法相比[9]，利伐沙班标准曲线线性范围较宽（5～500 ng·mL-1），同时定量下限为5 ng·mL-1，低于服药稳态后的谷浓度，能够满足进行TDM 与临床药动学研究的快速监测。

直接作用的口服抗凝药虽与华法林相比具有更好的安全性，一般情况下不需要进行常规治疗药物监测；但由于其吸收速度快，给药2～4 h 可达到峰值，药动学变异系数较大，可达到30%～40%[10]。据有关研究表明，利伐沙班在每日剂量20 mg 时，2～4 h达到峰值，其峰浓度中值为270（189～419）ng·mL-1，谷浓度中值为26（6～87）ng·mL-1，谷浓度与峰浓度之间相差8～10 倍，半衰期6～13 h[5]。在固定剂量下，利伐沙班引起的出血风险和治疗效果，也提示着患者个体间差异；同时目前缺乏标准化的抗凝血功能监测和抗凝逆转剂，增加了临床应用风险[11]。如上种种原因需在一定的情况下对DOACs 进行监测，例如创伤、紧急手术和溶栓治疗窗口内的近期卒中、怀疑药物相互作用等。此外，对于某些特殊患者如肾功能不全和胃肠吸收不良的、特别是老年人，日常监测也是必要的。

本研究对3 例服用利伐沙班达到稳态患者的血药浓度进行了检测，结果发现谷浓度与峰浓度分别为（27.5±12.4）ng·mL-1与（120.8±27.4）ng·mL-1，与国外研究接近且存在较大个体变异。可以预测对服用利伐沙班的特定患者进行TDM 具有较大临床意义。