穴位贴敷治疗对急性腹泻小儿肠道菌群的影响

张银娇，贾金荣，龙小慧，林丽玉，陈步信，龙雪微

腹泻病是我国儿童最常见的疾病之一，轻症者仅有大便性状改变和大便次数增多等消化道症状，严重者可出现电解质紊乱、脱水、全身中毒症状等并发症，是婴幼儿主要的致死原因之一[1]。但小儿在服药及静脉输液等方面均存在一定的困难，中药穴位贴敷疗法运用方便，能免去上述困难，且成本低，在临床上也取得明显良效。本研究通过观察穴位贴敷治疗小儿急性腹泻的临床疗效及对肠道菌群的检测分析，初步阐明穴位贴敷治疗对急性腹泻小儿肠道菌群的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年8月至2019年12月在我院就诊治疗的急性腹泻小儿194例，按随机数字表法分为对照组98例和观察组96例。两组患儿在性别、年龄、体质量、病程、大便次数及病情的严重程度方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组基线资料比较

1.2 急性腹泻的诊断及病情分类标准[2-3]

1.2.1 诊断标准 (1)大便次数≥3次/天，较平时增多；(2)大便性状改变：呈水样便、稀烂便、黏液样便或脓血样便；(3)病程<2周。

1.2.2 病情分类 (1)轻型：无脱水等相关腹泻并发症的表现。(2)中型：有轻度中毒或轻、中度脱水等相关腹泻并发症表现。(3)重型：有重度脱水或明显中毒(体温不升或高热、甚至惊厥、面色苍白、烦躁、精神萎靡、嗜睡、血白细胞计数明显升高等)相关腹泻并发症表现。

1.3 纳入标准 (1)符合以上诊断标准及病情分类为轻、中型者；(2)年龄6个月至3周岁；(3)纳入研究前告知并获得法定监护人知情同意，能配合门诊或电话随访。

1.4 排除标准 (1)有过敏史、局部粘贴的穴位有湿疹或其他皮肤病不适合穴位贴敷者；(2)就诊前1周内已开始应用益生菌等腹泻相关药物治疗者。

1.5 治疗方法 对照组：口服蒙脱石散及对症支持，如建议积极通过口服补充液体，如有脱水及电解质紊乱，及时予静脉补液，并给予专业的合理喂养指导。观察组：根据对照组治疗方法加用中药穴位贴敷治疗。穴位选取：神阙、天枢、中脘、脾俞。中药选取：肉桂、干姜、苍术、吴茱萸、木香、石榴皮；由本院药剂科统一购置磨成粉末，制成小药饼(直径1 cm、厚度0.5 cm左右)，将药饼固定敷到相应穴位，每日1次，1次2 h。两组治疗疗程均为3 d。

1.6 观察指标 在开始治疗前、治疗期间每日均由专人记录患儿大便性状、大便次数、尿量、食欲及精神等临床症状，并填写临床症状调查问卷；留取粪便标本应用细菌的16S rRNA荧光PCR方法检测其乳酸杆菌、双歧杆菌、肠杆菌及肠球菌的含量，通过计算B/E(双歧杆菌/肠杆菌)比值，由此来评估肠道定植抗力情况。

1.7 标本的采集与PCR检测

1.7.1 标本的采集 在两组研究对象开始治疗前及治疗3 d后分别采集两组患儿的粪便标本，取自然排出的新鲜粪便5 g左右置于密闭的无菌离心管中，统一置于-80 ℃冰箱备用。

1.7.2 PCR引物及探针设计与合成 在BLAST基因库内查找各细菌的16S rRNA基因序列，设计合成乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌及肠杆菌种特异性引物和探针(苏州晶科生物科技有限公司合成)，与基因库比对探针和引物的特异性。

1.7.3 细菌DNA的提取 取冻存的粪便标本复融，电子天平称取1 g标本，使用QIAampDNA stool Mini Kit试剂盒(德国Qiagen公司)提取粪便标本内的细菌DNA，总DNA浓度使用紫外分光光度计检测。

1.7.4 荧光定量PCR扩增条件 95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40个循环；所有实验都设阴性对照，每个样本均有3个平行复孔；所有RT-PCR反应在Light-Cycle 480上进行，反应结束后根据得到的扩增曲线、溶解曲线分析产物的特异性，标准曲线是根据不同稀释梯度DNA的循环阈值制作而成。

1.8 疗效判定标准 参照《儿科疾病诊断与疗效标准》[4]。(1)治愈:治疗72 h内全身症状消失，粪便性状恢复正常、次数正常；(2)好转:治疗72 h时全身症状明显改善，粪便性状明显好转及次数明显减少；(3)无效:治疗72 h时全身症状无好转甚至恶化，粪便性状无好转，次数无减少。

2 结果

2.1 两组临床疗效比较 观察组治愈率高于对照组，两组总体疗效比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组临床疗效比较[n(%)]

注：与对照组比较，U=2.13，P<0.05。

2.2 两组治疗前后肠道菌群及B/E值比较 见表3。

表3 两组治疗前后肠道菌群及B/E值比较

注：与对照组比较，at=2.22，2.28，2.42，5.67，P<0.05。

表3结果表明，两组治疗前留取粪便标本进行肠道菌群检测，其双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌的含量及B/E值比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后菌群检测结果提示观察组双歧杆菌及乳酸杆菌含量及B/E值高于对照组，肠杆菌含量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组肠球菌含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

研究表明，大约有1 000种微生物群在人体肠道内定植，定植的细菌总量更是多达1014个，是人体细胞总数的10倍以上[5]。根据细菌对宿主的作用人体肠道内的细菌可分为共生菌、条件致病菌、致病菌，其中共生菌是肠道的优势菌群，占肠道微生物的99%以上，主要由厌氧菌、兼性厌氧菌构成，如双歧杆菌、乳杆菌和拟杆菌，它们共同参与了人体各种重要生理过程，如食物分解、免疫调节、防御反应和新陈代谢等等；而条件致病菌在肠道内数量也比较多，以兼性厌氧菌为主，如肠杆菌、肠球菌等，在正常情况下它们能与共生菌达成生态平衡，但在肠道菌群紊乱时便会出现大量生长及增殖，打破这种生态平衡而成为致病菌[6-7]。在临床上小儿腹泻病可由多种原因引起，虽然不同致病菌引起的腹泻各有其不一样的临床特点和过程，但是均存在程度不同的肠道微生态环境失衡。发生腹泻时，人体肠道的内环境会发生变化，婴幼儿的变化则更为明显，正常微生物菌群赖以生存的环境被破坏了，正常菌群数量会出现减少，而条件致病菌数量则不断地增长，主要表现为肠杆菌增加，而双歧杆菌、乳酸杆菌等优势菌均显著减少，这种菌群微生态失衡将进一步加重腹泻症状，使两者之间形成一种恶性循环[8]。因此纠正肠道菌群失调是治疗腹泻的基本条件及必要治疗措施。在临床治疗上，通过积极恢复人体肠道菌群微生态环境的平衡，可以形成一个抑制致病菌生长、有利于肠道功能正常发挥的良好状态。肠道菌群微生态的平衡是肠道黏膜形成生物屏障的一个重要因素，研究证实它也影响着肠道的其他功能，如机械屏障、免疫屏障、化学屏障等，肠道的各种屏障功能可以防止微生物及其产物、食物抗原及有害大分子物质穿过肠黏膜[9]，从而起到防治腹泻的作用。

双歧杆菌、乳杆菌等肠道固有菌通过生态平衡、生物拮抗、免疫作用及产生抗菌物质等多种途径发挥防治腹泻的作用。研究发现，双歧杆菌数量与肠黏膜厚度及绒毛高度呈正相关，B/E值与回肠黏膜厚度和绒毛高度正相关，表明以双歧杆菌为代表的厌氧菌在维系肠黏膜结构完整方面发挥重要作用[10-11]。双歧杆菌和乳酸杆菌的定植抗力能调节肠道菌群的平衡，有效抑制损害肠道功能和诱发各种疾病的有害致病菌的生长，维护肠道生物屏障的完整及肠道微生态的平衡[12-13]；上述两种菌群还能够通过分泌某些抗菌物质，并形成化学屏障，且在体内能发酵糖类，产生醋酸和乳酸等物质，使肠内处于偏酸环境，能很好的抑制病原菌生长和繁殖，达到减轻腹泻症状的目的；在肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌还可产生具有抗菌活性的物质，如细菌素、亲脂分子、过氧化氢和乙醛等等，同时也可减少肠腔内的有害物质，如胺及氨等，也降低了内毒素的影响，缓解人体肠道菌群的失调[14]。双歧杆菌还可通过刺激肠道淋巴组织，进一步促进分泌型IgA的分泌，增强肠道黏膜的免疫功能，抑制病原菌损伤[15]。研究发现，双歧杆菌还可降低腹泻病例血浆胃泌素和胃动素的分泌水平，使肠道黏膜对水和电解质的分泌减少及胃排空和肠蠕动减慢，腹泻症状能更快减轻[16]。

小儿腹泻病主要病机是脾虚湿盛，中医治疗以运脾化湿止泻为法。本研究中所选用的药物为肉桂、干姜、苍术、吴茱萸、木香及石榴皮，其中苍术燥湿健脾，肉桂、干姜及吴茱萸温阳化湿助运，木香化湿和中理气，石榴皮涩肠止泻；药理学研究发现，上述药物均含有多种挥发油成分，具有良好的透皮吸收效果与轻微的皮肤刺激作用[17]，可起到药物透皮吸收和穴位刺激的双重治疗作用。本研究所选用穴位为脾俞、中脘、神阙及天枢，其中脾俞能健脾和胃、利湿升清，中脘能和胃健脾、降逆利水，天枢能振奋腑气、调理气机，神阙能温中助运健脾。药物与穴位配合共奏健脾助运、化湿止泻之功效。最近的动物实验证实，通过刺激大鼠的天枢及足三里等穴位，可改善腹泻型肠易激综合征大鼠的腹泻症状，高通量测序技术检测发现其肠道菌群的丰富度及多样性指数升高，乳酸杆菌科和双歧杆菌科的丰度上升[18]。小儿皮肤娇嫩，对穴位刺激的敏感性较高，易于接收并传递治疗信息，将刺激信号可上传到中枢神经系统兴奋迷走神经，可提高多种消化酶的活力，调节胃肠激素及消化液等物质的分泌，使胃肠蠕动更加规律[19]，这些因素都会对肠道菌群定植的内环境产生一定影响，从而起到调整肠道菌群微生态环境平衡的作用。本研究发现，通过中药穴位贴敷治疗小儿急性腹泻有确切的临床疗效，能减少大便次数，改善大便性状，使腹泻得到控制，其总体疗效及治愈率观察组均高于对照组(P<0.05)；而针对粪便的双歧杆菌及乳酸杆菌含量检测，观察组治疗后也均高于对照组(P<0.05)，B/E值大于1且明显高于对照组(P<0.05)，提示通过穴位贴敷治疗可提高小儿肠道内源性双歧杆菌、乳酸杆菌专性厌氧菌的含量，肠道定植抗力也得到提高，同时能有效抑制致病菌或条件致病菌的生长与繁殖，调节平衡了肠道微生态环境，从而达到治疗腹泻的目的。对在服药及输液治疗等用药方面均存在一定困难的小儿患者中，中药贴敷是一种经济方便、值得推广应用的疗法。