高效液相色谱法测定松藻多糖中醛糖的绝对构型

李娜?于金换

摘 要：本论文通过高效液相色谱（HPLC）法对3个松藻多糖组分进行单糖组成及单糖绝对构型的测定，该方法简单快速，所需的高效液相色谱仪及C18色谱柱在实验室普遍应用，为天然多糖中单糖绝对构型的测定提供参考。

关键词：高效液相色谱法;醛糖;绝对构型

醛糖是生物分子中最重要的结构成分之一，如多糖、核酸、糖脂和糖蛋白等。此外，植物中存在大量的次生代谢物，如萜类、类固醇和类黄酮，它们与醛糖结合，以糖苷的形式存在。醛糖是具有旋光活性的化合物，在天然产物化学中需要确认其绝对构型。如果糖基的绝对构型没有确定，一个复杂多糖的结构表征是不完整的。因此，更可靠和简便的确定单糖绝对构型的方法是阐明复杂多糖完整结构的有价值的工具。目前已应用的测定方法有高效液相色谱法、气液色谱或气质联用、毛细管电泳法。然而，使用配备紫外检测器和C18反相柱的高效液相色谱来测定单糖绝对构型的研究并不多，本文采用一种简便快速的高效液相色谱法鉴别松藻多糖中醛糖的绝对构型。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

单糖标准品、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），美国Sigma-Aldrich公司;乙腈（色谱纯），美国Tedia公司;L-半胱氨酸甲酯、异硫氰酸邻甲苯酯等其它试剂均为国产分析纯。Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Agilent公司）;高效液相色谱仪（Agilent 1260，美国Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 单糖组成分析

3个松藻来源的多糖组分分别为CP1、CP2、CP3，采用PMP柱前衍生高效液相色谱法对单糖组成进行分析。

柱前衍生：取完全酸水解样品及浓度为10 mg/mL的标准品混合溶液各100 μL，加入120 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和100 μL 0.3 mol/L的氢氧化钠溶液，70 ℃水浴中反应1 h，然后加入100 μL 0.3 mol/L的HCl溶液终止反应，萃取，离心，上清液经0.22 μm的滤膜过滤，即可进行HPLC分析。

色谱条件：色谱柱为Agilent Ecli-pse XDB-C18（5 μm，4.6 μm×25.0 cm）;柱温为35 ℃;检测器为紫外检测器（波长254 nm）;进样量为10 μL;流动相为乙腈：磷酸盐缓冲液=17∶83（V∶V）;流速为1.0 mL/min。

将样品色谱图与单糖标准品色谱图比较，根据各峰的保留时间可知单糖种类，根据峰面积计算摩尔比。

1.2.2 单糖绝对构型（D/L）的测定

采用高效液相色谱法对3个松藻多糖中主要单糖种类的绝对构型进行测定[1]。

衍生物制备：取单糖标准品和完全酸水解的多糖样品各2 mg，分别置于两个EP管中，各加入2 mg L-半胱氨酸甲酯和0.4 mL吡啶，于60 ℃水浴反应1 h，然后加入2 mg异硫氰酸邻甲苯酯，于60 ℃水浴中反应1 h，过滤，即可进行高效液相色谱分析。对比标准品和样品的液相色谱图上的保留时间，即可得知样品中单糖的绝对构型。

色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 μm×25.0 cm）;柱温为35 ℃;检测器为紫外检测器（波长250 nm）;流动相为乙腈∶蒸馏水=25∶75（V∶V）;进样量为10 μL;流速为0.8 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 单糖组成分析

将高效液相色谱图将松藻多糖的保留时间与多糖标准品进行比较，单糖组成百分比结果显示：CP1主要由49.52%的阿拉伯糖和48.75%的半乳糖组成，另外含有1.73%的葡萄糖;CP2主要含有96.44%的半乳糖，还有3.56%的葡萄糖;CP3主要含有85.4%的葡萄糖，还有10.38%的半乳糖和4.22%的甘露糖。

2.2 单糖绝对构型（D/L）的测定

采用高效液相色谱法测定多糖中主要单糖种类的绝对构型，仅适用于醛糖的测定。将单糖标准品和多糖样品的液相色谱图进行对比，根据保留时间，结合单糖组成测定结果得出，CP1主要由阿拉伯糖和半乳糖组成，其绝对构型分别是L-Ara和D-Gal;CP2主要由半乳糖组成，其绝对构型为D-Gal;CP3主要由葡萄糖组成，其绝对构型为D-Glc。

3 结语

本文对3个松藻多糖组分进行单糖组成及单糖绝对构型的测定，CP1主要由阿拉伯糖和半乳糖组成，其绝对构型分别是L-Ara和D-Gal;CP2主要由半乳糖组成，其绝对构型为D-Gal;CP3主要由葡萄糖组成，其绝对构型为D-Glc。本方法所使用的配备紫外检测器和C18反相色谱柱的高效液相色谱系统是现在实验室中常见的分析系统，简单易行。目前正在优化反应条件，以期能应用于天然产物的结构测定。

参考文献

[1]Tanaka T，Nakashima T，Ueda T，et al.Facile Discrimination of Aldose Enantiomers by Reversed-phase HPLC. Chemical & Pharmaceutical Bulletin，2007，55（6）：899-901.

基金項目：山东省高等学校科研发展计划项目（编号：J18KA282）;烟台职业学院校级课题（编号：2019001）。

作者简介：李娜（1987—），女，山东青岛人，博士，讲师。研究方向：海藻多糖。